Takk for at du besøker Nature.com.Nettleserversjonen du bruker har begrenset CSS-støtte.For best resultat anbefaler vi at du bruker en nyere versjon av nettleseren din (eller deaktiverer kompatibilitetsmodus i Internet Explorer).I mellomtiden, for å sikre kontinuerlig støtte, viser vi nettstedet uten styling eller JavaScript.
Oppdagelsen og fordelaktig bruk av naturlige produkter kan bidra til å forbedre menneskers liv.Planteveksthemmende kjemikalier er mye brukt som ugressmidler for å kontrollere ugress.På grunn av behovet for å bruke ulike typer ugressmidler, er det behov for å identifisere forbindelser med nye virkningsmekanismer.I denne studien oppdaget vi en ny N-alkoksypyrrolforbindelse, kumamonamid, fra Streptomyces werraensis MK493-CF1 og etablerte den komplette synteseprosessen.Gjennom biologiske aktivitetsanalyser oppdaget vi at urs-monoaminsyre er et syntetisk mellomprodukt av urs-monoamid og et potensieltplanteveksthemmer.I tillegg har vi utviklet ulike urbenonsyrederivater, inkludert urbenyloksyderivatet (UDA), som har høy herbicid aktivitet uten å påvirke veksten av HeLa-celler negativt.Vi fant også at urmotonsyrederivater forstyrrer plantemikrotubuli;i tillegg påvirker KAND aktinfilamenter og induserer celledød;Disse mangefasetterte effektene skiller seg fra de kjente mikrotubuli-hemmere og antyder en ny virkningsmekanisme for ursonsyre, som representerer en viktig fordel i utviklingen av nye herbicider.
Oppdagelsen og den praktiske anvendelsen av gunstige naturprodukter og deres derivater er et middel til å forbedre kvaliteten på menneskers liv.Sekundære metabolitter produsert av mikroorganismer, planter og insekter har ført til store fremskritt innen medisin og landbruk.Mange antibiotika og antileukemimedisiner er utviklet fra naturlige produkter.I tillegg ulike typerplantevernmidler, sopp- og ugressmidler utvinnes fra disse naturlige produktene for bruk i landbruket.Spesielt ugrasbekjempende ugressmidler er viktige verktøy for å øke avlingene i moderne landbruk, og ulike typer forbindelser brukes allerede kommersielt.Flere cellulære prosesser i planter, som fotosyntese, aminosyremetabolisme, celleveggsyntese, regulering av mitose, fytohormonsignalering eller proteinsyntese, regnes som typiske mål for ugressmidler.Forbindelser som hemmer mikrotubulus funksjon er en vanlig klasse av ugressmidler som påvirker plantevekst ved å påvirke mitotisk regulering2.
Mikrotubuli er komponenter i cytoskjelettet og er mye konservert i eukaryote celler.Tubulin-heterodimeren består av α-tubulin og β-tubulin som danner lineære mikrotubuli-protofilamenter, med 13 protofilamenter som danner en sylindrisk struktur.Mikrotubuli spiller flere roller i planteceller, inkludert å bestemme celleform, celledeling og intracellulær transport3,4.Planteceller inneholder mikrotubuli under interfaseplasmamembranen, og disse såkalte kortikale mikrotubuli antas å kontrollere organiseringen av cellulosemikrofibriller gjennom regulering av cellulosesyntasekomplekser4,5.Kortikale mikrotubuli av rotepidermale celler, tilstede i sonen med rask forlengelse av rotspissen, er lokalisert lateralt, og cellulosemikrofibre følger disse mikrotubuli og begrenser retningen for celleutvidelse, og fremmer derved anisotrop celleforlengelse.Derfor er mikrotubulusfunksjon nært knyttet til plantemorfologi.Aminosyresubstitusjoner i gener som koder for tubulin forårsaker skjevheter i kortikale mikrotubuli-arrayer og venstre- eller høyresidig vekst i Arabidopsis 6,7.Tilsvarende kan mutasjoner i mikrotubuli-assosierte proteiner som regulerer mikrotubuli-dynamikk også føre til forvrengt rotvekst8,9,10,11,12,13.I tillegg forårsaker behandling med mikrotubuli-forstyrrende ugressmidler som disopyramid, også kjent som pretilaklor, venstresidig skrå rotvekst14.Disse dataene indikerer at presis regulering av mikrotubulus funksjon er avgjørende for å bestemme retningen for plantevekst.
Ulike typer mikrotubuli-hemmere er oppdaget, og disse medikamentene har gitt betydelige bidrag til cytoskjelettforskning, samt til landbruk og medisin2.Spesielt kan oryzalin, dinitroanilinforbindelser, disopyramid, benzamidrelaterte forbindelser og deres analoger hemme mikrotubulus funksjon og dermed hemme plantevekst.Derfor er de mye brukt som ugressmidler.Men siden mikrotubuli er en viktig komponent i plante- og dyreceller, er de fleste mikrotubulihemmere cytotoksiske for begge celletyper.Derfor, til tross for deres anerkjente nytte som ugressmidler, brukes et begrenset antall antimikrotubulusmidler til praktiske formål.
Streptomyces er en slekt av familien Streptomyces, som inkluderer aerobe, gram-positive, filamentøse bakterier og er viden kjent for sin evne til å produsere et bredt spekter av sekundære metabolitter.Derfor regnes det som en av de viktigste kildene til nye biologisk aktive naturprodukter.I den nåværende studien oppdaget vi en ny forbindelse kalt kumamonamid, som ble isolert fra Streptomyces werraensis MK493-CF1 og S. werraensis ISP 5486. Ved hjelp av spektralanalyse og full spektralanalyse ble strukturen til kumamonamid karakterisert og dets unike N-alkoksypyrrolskjelett. var bestemt.syntese.Ursmonsyre, et syntetisk mellomprodukt av ursmonoamid og dets derivater, ble funnet å hemme veksten og spiringen av den populære modellplanten Arabidopsis thaliana.I en struktur-aktivitet-forholdsstudie fant vi at en forbindelse med C9 modifisert til ursonsyre, kalt nonyloksyderivat av ursonsyre (KAND), forbedrer den hemmende effekten på vekst og spiring betydelig.Spesielt påvirket den nyoppdagede planteveksthemmeren også veksten av tobakk og leverurt og var ikke cellegift for bakterier eller HeLa-celler.Dessuten induserer noen urmotonsyrederivater en forvrengt rotfenotype, noe som antyder at disse derivatene direkte eller indirekte påvirker mikrotubuli.I samsvar med denne ideen indikerer våre observasjoner av mikrotubuli merket enten immunhistokjemisk eller med fluorescerende proteiner at KAND-behandling depolymeriserer mikrotubuli.I tillegg forstyrret behandling med kumamotonsyrederivater aktinmikrofilamenter.Dermed har vi oppdaget en ny planteveksthemmer hvis unike virkningsmekanisme innebærer ødeleggelse av cytoskjelettet.
Stamme MK493-CF1 ble isolert fra jord i Shinagawa-ku, Tokyo.Stamme MK493-CF1 dannet godt forgrenet stromalt mycel.Delsekvensen til 16S ribosomale RNA-genet (1422 bp) ble bestemt.Denne stammen er veldig lik S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: typisk stamme, 99,93%).Basert på dette resultatet ble det bestemt at denne stammen var nært beslektet med typestammen S. werraensis.Derfor ga vi foreløpig navn til denne stammen S. werraensis MK493-CF1.S. werraensis ISP 5486T produserer også de samme bioaktive forbindelsene.Siden det var lite tidlig forskning på å få naturlige produkter fra denne mikroorganismen, ble det utført ytterligere kjemisk forskning.Etter dyrking av S. werraensis MK493-CF1 på byggmedium ved faststofffermentering ved 30°C i 14 dager, ble mediet ekstrahert med 50 % EtOH.60 ml prøve ble tørket for å oppnå 59,5 mg råekstrakt.Råekstraktet ble underkastet revers fase HPLC for å gi N-metoksy-lH-pyrrol-2-karboksamid (1, kalt kumamonamid, 36,0 mg).Den totale mengden 1 er omtrent 60 % av råekstraktet.Derfor bestemte vi oss for å studere i detalj egenskapene til kumamotoamid 1.
Coumamonamide 1 er et hvitt amorft pulver og høyoppløselig massespektrometri (HRESIMS) bekrefter C6H8N2O2 (fig. 1).Det C2-substituerte pyrrolfragmentet av denne forbindelsen er karakterisert ved δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH i 1H NMR-spektrum: 4,5 Hz , H-5) og δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), og 13C NMR-spekteret viser tilstedeværelsen av fire sp2-karbonatomer.Tilstedeværelsen av en amidgruppe ved C2-posisjonen ble vurdert ved HMBC-korrelasjon fra C-3-protonet til amidkarbonylkarbonet ved δC 161,1.I tillegg indikerer 1H og 13C NMR-topper ved δH 4,10 (3H, S) og δC 68,3 tilstedeværelsen av N-metoksygrupper i molekylet.Selv om den riktige plasseringen av metoksygruppen ennå ikke var bestemt ved bruk av spektroskopisk analyse som forsterket forskjellsspektroskopi og nukleær Overhauser-forkortelse (NOEDF), ble N-metoksy-1H-pyrrol-2-karboksamid den første kandidatforbindelsen.
For å bestemme den korrekte strukturen til 1 ble en total syntese utført (fig. 2a).Behandling av kommersielt tilgjengelig 2-aminopyridin 2 med m-CPBA resulterte i det tilsvarende N-oksid 3 i kvantitativt utbytte.Etter 2-aminoazideringen av 2 ble cyklokondensasjonsreaksjonen beskrevet av Abramovich utført i benzen ved 90°C for å oppnå den ønskede 1-hydroksy-lH-pyrrol-2-karbonitril 5 i gram.Hastighet 60 % (to trinn).15,16.Metylering og hydrolyse av 4 ga deretter 1-metoksy-1H-pyrrol-2-karboksylsyre (kalt "cumotonsyre", 6) i godt utbytte (70 %, to trinn).Til slutt ga amidering via syreklorid-mellomprodukt 6 ved bruk av vandig ammoniakk Kumamoto-amid 1 i 98 % utbytte.Alle spektraldata for syntetisert 1 var lik isolert 1, så strukturen til 1 ble bestemt;
Generell syntese og analyse av den biologiske aktiviteten til urbenamid og urbensyre.(a) Total syntese av Kumamoto-amid.(b) Syv dager gamle villtype Arabidopsis Columbia (Col) frøplanter ble dyrket på Murashige og Skoog (MS) plater som inneholdt coumamonamid 6 eller coumamonamid 1 ved de angitte konsentrasjonene.Målestokk = 1 cm.
Først vurderte vi de biologiske aktivitetene til urbenamid og dets mellomprodukter for deres evne til å modulere plantevekst.Vi tilsatte forskjellige konsentrasjoner av ursmonamid 1 eller ursmonsyre 6 til MS-agarmedium og dyrkede Arabidopsis thaliana-frøplanter på dette mediet.Disse analysene viste at høye konsentrasjoner (500 μM) av 6 hemmet rotvekst (fig. 2b).Deretter genererte vi forskjellige derivater ved å erstatte N1-posisjonen til 6 og utførte studier av struktur-aktivitetsforhold på dem (den analoge synteseprosessen er beskrevet i støtteinformasjonen (SI)).Arabidopsis-frøplanter ble dyrket på et medium som inneholdt 50 μM ursonsyrederivater, og rotlengden ble målt.som det vises på bildet.Som vist i figurene 3a, b og S1, har coumamosyrer forskjellige lengder av lineære alkoksykjeder (9, 10, 11, 12 og 13) eller store alkoksykjeder (15, 16 og 17) i N1-posisjonen.Derivatene viste signifikant inhibering av rotvekst.I tillegg fant vi at påføring av 200 μM 10, 11 eller 17 hemmet spiring (fig. 3c og S2).
Studie av struktur-aktivitetsforholdet til Kumamoto-amid og relaterte forbindelser.(a) Struktur og synteseskjema for analoger.(b) Kvantifisering av rotlengde til 7 dager gamle frøplanter dyrket på MS-medium med eller uten 50 μM kumamonamidderivater.Stjerner indikerer signifikante forskjeller med falsk behandling (t-test, s< 0,05).n>18. Data er vist som gjennomsnitt ± SD.nt betyr "ikke testet" fordi mer enn 50 % av frøene ikke spiret.(c) Kvantifisering av spirehastighet for behandlede frø inkubert i 7 dager i MS-medium med eller uten 200 μM kumamonamid og relaterte forbindelser.Stjerner indikerer signifikante forskjeller med falsk behandling (chi-square test).n=96.
Interessant nok reduserte tilsetningen av alkylsidekjeder lengre enn C9 den hemmende aktiviteten, noe som tyder på at kumamotoinsyrerelaterte forbindelser krever sidekjeder av en viss størrelse for å vise sin biologiske aktivitet.
Fordi struktur-aktivitetsforholdsanalyse viste at C9 ble modifisert til ursonsyre og nonyloksyderivatet av ursonsyre (heretter referert til som KAND 11) var den mest effektive planteveksthemmeren, utførte vi en mer detaljert karakterisering av KAND 11. Behandling av Arabidopsis med 50 μM KAND 11 forhindret nesten helt spiring, mens lavere konsentrasjoner (40, 30, 20 eller 10 μM) av KAND 11 hemmet rotvekst på en doseavhengig måte (fig. 4a, b).For å teste om KAND 11 påvirker rotmeristems levedyktighet, undersøkte vi rotmeristemer farget med propidiumjodid (PI) og målte meristemarealstørrelsen.Størrelsen på meristemet til frøplanter dyrket på et medium som inneholder 25 μM KAND-11 var 151,1 ± 32,5 μm, mens størrelsen på meristemet til frøplanter dyrket på et kontrollmedium inneholdende DMSO var 264,7 ± 30,8 μm (fig. 4c, d) , som indikerer at KAND-11 gjenoppretter cellulær aktivitet.sprer seg.Rotmeristem.I samsvar med dette reduserte KAND 11-behandling mengden celledelingsmarkør CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS-signal i rotmeristemet (fig. 4e) 17.Disse resultatene indikerer at KAND 11 hemmer rotvekst ved å redusere celleproliferasjonsaktivitet.
Analyse av den hemmende effekten av urbenonsyrederivater (urbenyloksyderivater) på vekst.(a) 7 dager gamle villtype Col-frøplanter dyrket på MS-plater med de angitte konsentrasjonene av KAND 11. Skalastang = 1 cm.(b) Kvantifisering av rotlengde.Bokstaver indikerer signifikante forskjeller (Tukey HSD-test, s< 0,05).n>16. Data er vist som gjennomsnitt ± SD.(c) Konfokal mikroskopi av propidiumjodidfarget villtype Col-røtter dyrket på MS-plater med eller uten 25 μM KAND 11. Hvite parenteser indikerer rotmeristem.Målestokk = 100 µm.(d) Kvantifisering av rotmeristemstørrelse (n = 10 til 11).Statistiske forskjeller ble bestemt ved å bruke t-test (s< 0,05).Søylene representerer gjennomsnittlig meristemstørrelse.(e) Differensiell interferenskontrast (DIC) mikroskopi av et rotmeristem som inneholder CDKB2-konstruksjonen;1pro: CDKB2;1-GUS farget og farget på 5 dager gamle frøplanter dyrket på MS-plater med eller uten 25 µM KAND-analyse.
Fytotoksisiteten til KAND 11 ble videre testet ved bruk av en annen tofrøbladig plante, tobakk (Nicotiana tabacum), og en viktig landplantemodellorganisme, levermost (Marchantia polymorpha).Som i tilfellet med Arabidopsis ga tobakk SR-1 frøplanter dyrket på medium som inneholdt 25 μM KAND 11 kortere røtter (fig. 5a).I tillegg spiret 40 av 48 frø på plater som inneholder 200 μM KAND 11, mens alle 48 frø spiret på falske behandlede medier, noe som indikerer at høyere konsentrasjoner av KAND var signifikante (p< 0,05;chi test -square) hemmet spiringen av tobakk.(Fig. 5b).I tillegg var konsentrasjonen av KAND 11 som hemmet bakterievekst i leverwort lik den effektive konsentrasjonen i Arabidopsis (fig. 5c).Disse resultatene indikerer at KAND 11 kan hemme veksten av en rekke planter.Vi undersøkte deretter den mulige cytotoksisiteten til bjørnemonoamid-relaterte forbindelser i andre organismer, nemlig humane HeLa-celler og Escherichia coli-stamme DH5α, som representanter for henholdsvis høyere dyre- og bakterieceller.I en serie celleproliferasjonsanalyser observerte vi at kumamonamid 1, kumamonamidsyre 6 og KAND 11 ikke påvirket veksten av HeLa- eller E. coli-celler ved konsentrasjoner på 100 μM (fig. 5d, e).
Veksthemming av KAND 11 i ikke-Arabidopsis-organismer.(a) To uker gamle villtype SR-1 tobakksfrøplanter ble dyrket på vertikalt plasserte MS-plater som inneholdt 25 μM KAND 11. (b) To uker gamle villtype SR-1 tobakksfrøplanter ble dyrket på horisontalt plasserte MS-plater som inneholder 200 μM KAND 11. (c) To uker gamle villtype Tak-1-leverurtknopper dyrket på Gamborg B5-plater med de angitte konsentrasjonene av KAND 11. Røde piler indikerer sporer som sluttet å vokse i løpet av to ukers inkubasjon periode.(d) Celleproliferasjonsanalyse av HeLa-celler.Antall levedyktige celler ble målt ved faste tidsintervaller ved bruk av et celletellesett 8 (Dojindo).Som kontroll ble HeLa-celler behandlet med 5 μg/ml actinomycin D (Act D), som hemmer RNA-polymerase-transkripsjon og forårsaker celledød.Analyser ble utført i tre eksemplarer.(e) E. coli celleproliferasjonsanalyse.E. coli-vekst ble analysert ved å måle OD600.Som kontroll ble cellene behandlet med 50 μg/ml ampicillin (Amp), som hemmer bakteriell celleveggsyntese.Analyser ble utført i tre eksemplarer.
For å tyde virkningsmekanismen for cytotoksisitet forårsaket av uramidrelaterte forbindelser, analyserte vi urbensyrederivater på nytt med moderate hemmende effekter.som det vises på bildet.Som vist i figur 2b, 6a ga frøplanter dyrket på agarplater som inneholdt høye konsentrasjoner (200 μM) av urmotonsyre 6 kortere og venstrebuede røtter (θ = – 23,7 ± 6,1), mens frøplanter dyrket på kontrollmediet, frøplanter ga nesten rette røtter (θ = – 3,8 ± 7,1).Denne karakteristiske skråveksten er kjent for å skyldes dysfunksjon av kortikale mikrotubuli14,18.I samsvar med dette funnet induserte de mikrotubuli-destabiliserende medikamentene disopyramid og oryzalin lignende rotvipping under våre vekstforhold (fig. 2b, 6a).Samtidig testet vi urmotonsyrederivater og valgte flere av dem som i visse konsentrasjoner induserte skrå rotvekst.Forbindelsene 8, 9 og 15 endret rotvekstretningen ved henholdsvis 75 μM, 50 μM og 40 μM, noe som indikerer at disse forbindelsene effektivt kan destabilisere mikrotubuli (fig. 2b, 6a).Vi testet også det mest potente ursolsyrederivatet, KAND 11, ved en lavere konsentrasjon (15 µM) og fant at påføring av KAND 11 hemmet rotvekst og at rotvekstretningen var ujevn, selv om de hadde en tendens til å skråne mot venstre ( Figur C3)..Fordi høyere konsentrasjoner av mikrotubuli-destabiliserende legemidler noen ganger hemmer plantevekst i stedet for å forårsake rotvipping, vurderte vi deretter muligheten for at KAND 11 påvirker mikrotubuli ved å observere kortikale mikrotubuli i rotepidermale celler.Immunhistokjemi ved bruk av anti-β-tubulin antistoffer i epidermale celler av frøplanterøtter behandlet med 25 μM KAND 11 viste bortfall av nesten alle kortikale mikrotubuli i epidermale celler i forlengelsessonen (fig. 6b).Disse resultatene indikerer at kumamotonsyre og dens derivater virker direkte eller indirekte på mikrotubuli for å forstyrre dem, og at disse forbindelsene er nye mikrotubuli-hemmere.
Ursonsyre og dens derivater endrer kortikale mikrotubuli i Arabidopsis thaliana.(a) Rothellingsvinkel målt i nærvær av forskjellige urmotonsyrederivater ved de angitte konsentrasjonene.Effekten av to forbindelser kjent for å hemme mikrotubuli: disopyramid og oryzalin ble også analysert.Innsatsen viser standarden som brukes til å måle rotvekstvinkelen.Stjerner indikerer signifikante forskjeller med falsk behandling (t-test, s< 0,05).n>19. Målestokk = 1 cm.(b) Kortikale mikrotubuli i epidermale celler i forlengelsessonen.Mikrotubuli i villtype Arabidopsis Col-røtter dyrket på MS-plater med eller uten 25 μM KAND 11 ble visualisert ved immunhistokjemisk farging ved bruk av β-tubulin primære antistoffer og Alexa Fluor-konjugerte sekundære antistoffer.Målestokk = 10 µm.(c) Mitotisk struktur av mikrotubuli i rotmeristemet.Mikrotubuli ble visualisert ved bruk av immunhistokjemisk farging.Mitotiske strukturer, inkludert profasesoner, spindler og fragmoplaster, ble talt fra konfokale bilder.Piler indikerer mitotiske mikrotubulusstrukturer.Stjerner indikerer signifikante forskjeller med falsk behandling (t-test, s< 0,05).n>9. Målestokk = 50 µm.
Selv om Ursa har evnen til å forstyrre mikrotubulus funksjon, forventes dens virkningsmekanisme å være forskjellig fra typiske mikrotubuli depolymeriserende midler.For eksempel induserer høyere konsentrasjoner av mikrotubuli-depolymeriserende midler som disopyramid og oryzalin anisotropisk utvidelse av epidermale celler, mens KAND 11 ikke gjør det.I tillegg resulterte samtidig påføring av KAND 11 og disopyramid i en kombinert disopyramid-indusert rotvekstrespons og KAND 11-indusert vekstinhibering ble observert (fig. S4).Vi analyserte også responsen til den hypersensitive disopyramid 1-1 (phs1-1) mutanten til KAND 11. phs1-1 har en ikke-kanonisk tubulinkinasepunktmutasjon og produserer kortere røtter når den behandles med disopyramid9,20.phs1-1 mutante frøplanter dyrket på agarmedium som inneholder KAND 11 hadde kortere røtter som ligner på de som ble dyrket på disopyramid (fig. S5).
I tillegg observerte vi mitotiske mikrotubulistrukturer, slik som profasesoner, spindler og fragmoplaster, i rotmeristemet til frøplanter behandlet med KAND 11. I samsvar med observasjonene for CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, en signifikant reduksjon i antall mitotiske mikrotubuli ble observert (fig. .6c).
For å karakterisere cytotoksisiteten til KAND 11 ved subcellulær oppløsning, behandlet vi tobakk BY-2 suspensjonsceller med KAND 11 og observerte deres respons.Vi la først KAND 11 til BY-2-celler som uttrykker TagRFP-TUA6, som fluorescerende merker mikrotubuli, for å vurdere effekten av KAND 11 på kortikale mikrotubuli.Kortikal mikrotubuli-tetthet ble vurdert ved bruk av bildeanalyse, som kvantifiserte prosentandelen av cytoskjelettpiksler blant cytoplasmatiske piksler.Analyseresultatene viste at etter behandling med 50 μM eller 100 μM KAND 11 i 1 time, sank tettheten signifikant til henholdsvis 0,94 ± 0,74 % eller 0,23 ± 0,28 %, mens tettheten av celler behandlet med DMSO, utgjorde ±10.61 ± 10. % (fig. 7a).Disse resultatene stemmer overens med observasjonen i Arabidopsis at KAND 11-behandling induserer depolymerisering av kortikale mikrotubuli (fig. 6b).Vi undersøkte også BY-2-linjen med GFP-ABD-merkede aktinfilamenter etter behandling med samme konsentrasjon av KAND 11 og observerte at KAND 11-behandling forstyrret aktinfilamentene.Behandling med 50 μM eller 100 μM KAND 11 i 1 time reduserte aktinfilamenttettheten signifikant til henholdsvis 1,20 ± 0,62 % eller 0,61 ± 0,26 %, mens tettheten i DMSO-behandlede celler var 1,69 ± 0,69 %.7b).Disse resultatene står i kontrast til effektene av propyzamid, som ikke påvirker aktinfilamenter, og latrunculin B, en aktindepolymerisator som ikke påvirker mikrotubuli (SI figur S6).I tillegg påvirket ikke behandling med kumamonamid 1, kumamonamidsyre 6 eller KAND 11 mikrotubuli i HeLa-celler (SI figur S7).Dermed antas virkningsmekanismen til KAND 11 å være forskjellig fra den til kjente cytoskjelettforstyrrende stoffer.I tillegg avslørte vår mikroskopiske observasjon av BY-2-celler behandlet med KAND 11 begynnelsen av celledød under KAND 11-behandling og viste at andelen av Evans blåfargede døde celler ikke økte signifikant etter 30 minutter med KAND 11-behandling, mens etter 90 minutters behandling med 50 μM eller 100 μM KAND økte antall døde celler til henholdsvis 43,7 % eller 80,1 % (fig. 7c).Til sammen indikerer disse dataene at det nye ursolsyrederivatet KAND 11 er en plantespesifikk cytoskjeletthemmer med en tidligere ukjent virkningsmekanisme.
KAND påvirker kortikale mikrotubuli, aktinfilamenter og levedyktigheten til tobakks BY-2-celler.(a) Visualisering av kortikale mikrotubuli i BY-2-celler i nærvær av TagRFP-TUA6.BY-2-celler behandlet med KAND 11 (50 μM eller 100 μM) eller DMSO ble undersøkt med konfokalmikroskopi.Kortikal mikrotubuli-tetthet ble beregnet fra mikrofotografier av 25 uavhengige celler.Bokstaver indikerer signifikante forskjeller (Tukey HSD-test, s< 0,05).Målestokk = 10 µm.(b) Kortikale aktinfilamenter i BY-2-celler visualisert i nærvær av GFP-ABD2.BY-2-celler behandlet med KAND 11 (50 μM eller 100 μM) eller DMSO ble undersøkt med konfokalmikroskopi.Tettheten av kortikale aktinfilamenter ble beregnet fra mikrofotografier av 25 uavhengige celler.Bokstaver indikerer signifikante forskjeller (Tukey HSD-test, s< 0,05).Målestokk = 10 µm.(c) Observasjon av døde BY-2-celler ved Evans blåfarging.BY-2-celler behandlet med KAND 11 (50 μM eller 100 μM) eller DMSO ble undersøkt med lysfeltmikroskopi.n=3.Målestokk = 100 µm.
Oppdagelsen og anvendelsen av nye naturlige produkter har ført til betydelige fremskritt i ulike aspekter av menneskelivet, inkludert medisin og landbruk.Historisk forskning har blitt utført for å skaffe nyttige forbindelser fra naturressurser.Spesielt er aktinomyceter kjent for å være nyttige som antiparasittiske antibiotika for nematoder på grunn av deres evne til å produsere forskjellige sekundære metabolitter som avermectin, hovedforbindelsen av ivermectin og bleomycin og dets derivater, brukt medisinsk som et kreftmiddel21,22.På samme måte er en rekke ugressdrepende forbindelser blitt oppdaget fra actinomycetes, hvorav noen allerede brukes kommersielt1,23.Derfor betraktes analysen av actinomycete-metabolitter for å isolere naturlige produkter med ønskede biologiske aktiviteter som en effektiv strategi.I denne studien oppdaget vi en ny forbindelse, coumamonamid, fra S. werraensis og syntetiserte den.Ursonsyre er et syntetisk mellomprodukt av urbenamid og dets derivater.Det kan forårsake karakteristisk rotkrølling, vise moderat til sterk herbicid aktivitet og direkte eller indirekte skade plantemikrotubuli.Imidlertid kan virkningsmekanismen til urmotonsyre avvike fra den til eksisterende mikrotubuli-hemmere, siden KAND 11 også forstyrrer aktinfilamenter og forårsaker celledød, noe som antyder en reguleringsmekanisme som urmotonsyre og dens derivater påvirker et bredt spekter av cytoskjelettstrukturer..
Ytterligere detaljert karakterisering av urbenonsyre vil bidra til bedre å forstå virkningsmekanismen til urbenonsyre.Spesielt er neste mål å evaluere evnen til ursonsyre til å binde seg til reduserte mikrotubuli for å bestemme om ursonsyre og dens derivater virker direkte på mikrotubuli og depolymeriserer dem, eller om deres virkning resulterer i mikrotubuli destabilisering.I tillegg, i tilfelle der mikrotubuli ikke er et direkte mål, vil identifisering av virkningsstedet og molekylære mål for ursonsyre på planteceller bidra til ytterligere å forstå egenskapene til beslektede forbindelser og mulige måter å forbedre herbicid aktivitet.Vår bioaktivitetsanalyse avslørte den unike cytotoksiske evnen til ursonsyre på veksten av planter som Arabidopsis thaliana, tobakk og leverurt, mens verken E. coli eller HeLa-celler ble påvirket.Lite eller ingen toksisitet for dyreceller er en fordel med ursonsyrederivater hvis de er utviklet som ugressmidler for bruk i åpne landbruksområder.Faktisk, siden mikrotubuli er vanlige strukturer i eukaryoter, er deres selektive hemming i planter et nøkkelkrav for ugressmidler.For eksempel brukes propyzamid, et mikrotubuli-depolymeriserende middel som direkte binder til tubulin og hemmer polymerisering, som et ugressmiddel på grunn av dets lave toksisitet for dyreceller24.I motsetning til disopyramid har beslektede benzamider forskjellige målspesifisiteter.I tillegg til plantemikrotubuli, hemmer RH-4032 eller benzoksamid også mikrotubuli av henholdsvis dyreceller eller oomyceter, og zalilamid brukes som soppdrepende middel på grunn av dets lave fytotoksisitet25,26,27.Den nyoppdagede bjørnen og dens derivater viser selektiv cytotoksisitet mot planter, men det er verdt å merke seg at ytterligere modifikasjoner kan endre målspesifisiteten deres, og potensielt gi ytterligere derivater for kontroll av patogene sopp eller oomyceter.
De unike egenskapene til urbenonsyre og dens derivater er nyttige for deres utvikling som ugressmidler og bruk som forskningsverktøy.Betydningen av cytoskjelettet for å kontrollere plantecelleform er allment anerkjent.Tidligere studier har vist at planter har utviklet komplekse mekanismer for organisering av kortikal mikrotubuli ved å kontrollere mikrotubuli-dynamikk for å kontrollere morfogenesen på riktig måte.Et stort antall molekyler som er ansvarlige for reguleringen av mikrotubuliaktivitet er identifisert, og relatert forskning pågår fortsatt3,4,28.Vår nåværende forståelse av mikrotubuli-dynamikk i planteceller forklarer ikke fullt ut mekanismene for organisering av kortikal mikrotubuli.For eksempel, selv om både disopyramid og oryzalin kan depolymerisere mikrotubuli, forårsaker disopyramid alvorlig rotforvrengning mens oryzalin har en relativt mild effekt.Dessuten forårsaker mutasjoner i tubulin, som stabiliserer mikrotubuli, også dekstrorotasjon i røttene, mens paklitaksel, som også stabiliserer mikrotubuli-dynamikken, ikke gjør det.Derfor bør studier og identifisering av de molekylære målene til ursolsyre gi ny innsikt i reguleringen av plantekortikale mikrotubuli.På samme måte vil fremtidige sammenligninger av kjemikalier som er effektive for å fremme forvrengt vekst, som disopyramid, og mindre effektive kjemikalier, som oryzalin eller kumamotoric syre, gi ledetråder til hvordan forvrengt vekst oppstår.
På den annen side er forsvarsrelaterte cytoskjelettomorganiseringer en annen mulighet for å forklare cytotoksisiteten til ursonsyre.Infeksjon av et patogen eller introduksjon av en elicitor i planteceller forårsaker noen ganger ødeleggelse av cytoskjelettet og påfølgende celledød29.For eksempel har oomycete-avledet kryptoksantin blitt rapportert å forstyrre mikrotubuli og aktinfilamenter før tobakkscelledød, lik det som skjer med KAND-behandling30,31.Likhetene mellom forsvarsresponser og cellulære responser indusert av ursonsyre førte til at vi antok at de utløser vanlige cellulære prosesser, selv om en raskere og sterkere effekt av ursonsyre enn kryptoksantin er tydelig.Imidlertid har studier vist at forstyrrelse av aktinfilamenter fremmer spontan celledød, som ikke alltid er ledsaget av mikrotubulusforstyrrelser29.I tillegg gjenstår det å se om enten patogenet eller fremkalleren forårsaker forvrengt rotvekst, slik ursonsyrederivater gjør.Dermed er molekylær kunnskap som forbinder forsvarsresponser og cytoskjelettet et attraktivt problem å ta tak i.Ved å utnytte tilstedeværelsen av lavmolekylære forbindelser relatert til ursonsyre, samt en rekke derivater med varierende styrke, kan de gi muligheter til å målrette mot ukjente cellulære mekanismer.
Til sammen vil oppdagelsen og anvendelsen av nye forbindelser som modulerer mikrotubulus dynamikk gi kraftige metoder for å adressere de komplekse molekylære mekanismene som ligger til grunn for bestemmelse av plantecelleform.I denne sammenhengen kan den nylig utviklede forbindelsen urmotonsyre, som påvirker mikrotubuli og aktinfilamenter og induserer celledød, gi en mulighet til å tyde sammenhengen mellom mikrotubulikontroll og disse andre mekanismene.Dermed vil kjemisk og biologisk analyse ved bruk av urbenonsyre hjelpe oss å forstå de molekylære reguleringsmekanismene som styrer plantens cytoskjelettet.
Inokuler S. werraensis MK493-CF1 i en 500 mL forvirret Erlenmeyer-kolbe som inneholder 110 mL frømedium bestående av 2 % (vekt/volum) galaktose, 2 % (vekt/volum) essenspasta, 1 % (vekt/volum) Bacto-sammensetning .-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5 % (vekt/volum) maisekstrakt (KOGOSTCH Co., Ltd., Japan), 0,2 % (vekt/volum) (NH4)2SO4 og 0,2 % CaCO3 i avionisert vann.(pH 7,4 før sterilisering).Frøkulturene ble inkubert på en roterende rister (180 rpm) ved 27°C i 2 dager.Produksjonsdyrking via faststoffgjæring.Frøkulturen (7 ml) ble overført til en 500 ml K-1-kolbe inneholdende 40 g produksjonsmedium bestående av 15 g presset bygg (MUSO Co., Ltd., Japan) og 25 g avionisert vann (pH ikke justert) før sterilisering).).Fermentering ble utført ved 30°C i mørke i 14 dager.Fermenteringsmaterialet ble ekstrahert med 40 ml/flaske EtOH og sentrifugert (1500 g, 4°C, 10 min).Kultursupernatanten (60 ml) ble ekstrahert med en blanding av 10 % MeOH/EtOAc.Det organiske laget ble fordampet under redusert trykk for å oppnå en rest (59,5 mg), som ble utsatt for HPLC med gradienteluering (0–10 minutter: 90%) på en omvendt fasekolonne (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × lengde 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minutter: 90 % H2O/CH3CN til 70 % H2O/CH3CN (gradient), 35–45 minutter: 90 % H2O/EtOH, 45–155 minutter: 90 % H2O /EtOH til 100 % EtOH (gradient (gradient), 155–200 min: 100 % EtOH) ved en strømningshastighet på 1,5 ml/min ble kumamonamid (1, 36,0 mg) isolert som et hvitt amorft pulver.
Kumamotoamid(1);1H-NMR (500 MHz, CDC13) 6 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1 H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz, 1 H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1 H).4,08 (s, 3H);13C-NMR (125 MHz, CDC13) 5 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ beregnet verdi: 141.0659, målt verdi: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 15 cm.
Columbia frø (Col-0) ble hentet fra Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) med tillatelse for forskningsbruk.Col-0 frø ble forplantet og vedlikeholdt under våre laboratorieforhold og brukt som villtype Arabidopsis-planter.Arabidopsis-frø ble overflatesterilisert og dyrket i halvstyrke Murashige og Skoog-medium inneholdende 2 % sukrose (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05 % (vekt/volum) 2-(4-morfolino)etansulfonsyre (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) ).) og 1,5 % agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, ved 23 °C og konstant lys.Frø av phs1-1 mutanten ble levert av T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology).
Frø av stamme SR-1 ble levert av T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) og brukt som villtype tobakksplanter.Tobakksfrø ble overflatesterilisert og bløtlagt i sterilt vann i tre netter for å fremme spiring, deretter plassert i en halvstyrkeløsning inneholdende 2 % sukrose, 0,05 % (vekt/volum) MES og 0,8 % gellangummi (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige.og Skoog-medium) med pH 5,7 og inkubert ved 23°C under konstant lys.
Stamme Tak-1 ble levert av T. Kohchi (Kyoto University) og ble brukt som standard eksperimentell enhet for levermoststudien.Gemma ble oppnådd fra steriliserte dyrkede planter og deretter utsådd på Gamborg B5-medium (Fujifilm Wako Pure Chemical) inneholdende 1 % sukrose og 0,3 % gellangummi og inkubert ved 23°C under kontinuerlig lys.
Tobakk BY-2-celler (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) ble levert av S. Hasezawa (University of Tokyo).BY-2-celler ble fortynnet 95 ganger i modifisert Linsmeier- og Skoog-medium og supplert ukentlig med 2,4-diklorfenoksyeddiksyre32.Cellesuspensjonen ble blandet på en roterende rister ved 130 rpm ved 27°C i mørket.Vask cellene med 10 ganger volumet av friskt medium og resuspender i samme medium.BY-2 transgene cellelinjer som stabilt uttrykker mikrotubulusmarkøren TagRFP-TUA6 eller aktinfilamentmarkøren GFP-ABD2 under blomkålmosaikkvirus 35S-promotoren ble generert som beskrevet33,34,35.Disse cellelinjene kan vedlikeholdes og synkroniseres ved å bruke prosedyrer som ligner på de som ble brukt for den originale BY-2-cellelinjen.
HeLa-celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) (Life Technologies) supplert med 10% føtalt bovint serum, 1,2 U/ml penicillin og 1,2 μg/ml streptomycin i en 37°C inkubator med 5% CO2.
Alle eksperimenter beskrevet i dette manuskriptet ble utført i samsvar med japanske biosikkerhetsforskrifter og retningslinjer.
Forbindelser ble oppløst i dimetylsulfoksid (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) som stamløsninger og fortynnet i MS-medium for Arabidopsis og tobakk eller Gamborg B5-medium for leverurt.For rotvekstinhiberingsanalysen ble mer enn 10 frø per plate sådd på agarmedium inneholdende de angitte forbindelsene eller DMSO.Frø ble inkubert i et vekstkammer i 7 dager.Frøplantene ble fotografert og lengden på røttene ble målt.For Arabidopsis spiringsanalyse ble 48 frø per plate sådd på agarmedium som inneholdt 200 μM forbindelse eller DMSO.Arabidopsis-frø ble dyrket i et vekstkammer og antall spirede frøplanter ble talt 7 dager etter spiring (dag).For tobakksspireanalyse ble 24 frø per plate sådd på agarmedium inneholdende 200 μM KAND eller DMSO.Tobakksfrø ble dyrket i et vekstkammer og antall spirede frøplanter ble talt etter 14 dager.For leverwortvekstinhiberingsanalysen ble 9 embryoer fra hver plate sådd ut på agarmedium inneholdende de angitte konsentrasjonene av KAND eller DMSO og inkubert i et vekstkammer i 14 dager.
Bruk frøplanter farget med 5 mg/ml propidiumjodid (PI) for å visualisere rotmeristemorganisering.PI-signaler ble observert ved fluorescensmikroskopi ved bruk av et TCS SPE konfokalt laserskanningsmikroskop (Leica Microsystems).
Histokjemisk farging av røtter med β-glukuronidase (GUS) ble utført i henhold til protokollen beskrevet av Malami og Benfey36.Frøplanter ble fiksert i 90 % aceton over natten, farget med 0,5 mg/ml 5-brom-4-klor-3-indolyl-β-d-glukuronsyre i GUS-buffer i 1 time og plassert i en hydratisert kloraldehydløsning.(8 g kloralhydrat, 2 ml vann og 1 ml glyserol) og observert ved differensiell interferenskontrastmikroskopi ved bruk av et Axio Imager M1-mikroskop (Carl Zeiss).
Rotvinkler ble målt på 7 dager gamle frøplanter dyrket på vertikalt plasserte plater.Mål vinkelen til roten fra retningen til gravitasjonsvektoren som beskrevet i trinn 6.
Arrangementet av kortikale mikrotubuli ble observert som beskrevet, med mindre modifikasjoner av protokollen 37.Anti-β-tubulin antistoff (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) og Alexa Fluor 488-konjugert anti-mus IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) ble brukt som primære og sekundære antistoffer ved 1:1000 og 1:100 fortynninger, hhv.Fluorescensbilder ble tatt med et TCS SPE konfokalt laserskanningsmikroskop (Leica Microsystems).Skaff Z-stack-bilder og lag projeksjoner med maksimal intensitet i henhold til produsentens instruksjoner.
HeLa celleproliferasjonsanalyse ble utført ved bruk av Cell Counting Kit 8 (Dojindo) i henhold til produsentens instruksjoner.
Veksten av E. coli DH5α ble analysert ved å måle celletetthet i kultur ved bruk av et spektrofotometer ved 600 nm (OD600).
Cytoskjelettorganisering i transgene BY-2-celler ble observert ved bruk av et fluorescensmikroskop utstyrt med en CSU-X1 konfokal skanningsenhet (Yokogawa) og et sCMOS-kamera (Zyla, Andor Technology).Cytoskjeletttetthet ble vurdert ved bildeanalyse, som kvantifiserte prosentandelen av cytoskjelettpiksler blant cytoplasmatiske piksler i konfokale bilder ved bruk av ImageJ-programvare som beskrevet38,39.
For å påvise celledød i BY-2-celler ble en alikvot av cellesuspensjonen inkubert med 0,05 % Evans blue i 10 minutter ved romtemperatur.Selektiv Evans-blåfarging av døde celler avhenger av ekstrudering av fargestoffet fra levedyktige celler av den intakte plasmamembranen40.Fargede celler ble observert ved bruk av et lysfeltmikroskop (BX53, Olympus).
HeLa-celler ble dyrket i DMEM supplert med 10% FBS i en fuktet inkubator ved 37°C og 5% CO2.Celler ble behandlet med 100 μM KAND 11, kumamonsyre 6, kumamonamid 1, 100 ng/ml colcemid (Gibco), eller 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) i 6 timer ved 37 °C.Celler ble fiksert med MetOH i 10 minutter og deretter med acetat i 5 minutter ved romtemperatur.Faste celler ble inkubert med β-tubulin primært antistoff (1D4A4, Proteintech: 66240-1) fortynnet i 0,5 % BSA/PBS i 2 timer, vasket 3 ganger med TBST og deretter inkubert med Alexa Fluor geiteantistoff.488 1 time.– Muse-IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) og 15 ng/ml 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) fortynnet i 0,5 % BSA/PBS.Etter vask med TBST tre ganger, ble fargede celler observert på et Nikon Eclipse Ti-E invertert mikroskop.Bildene ble tatt med et avkjølt Hamamatsu ORCA-R2 CCD-kamera ved bruk av MetaMorph-programvare (Molecular Devices).
Innleggstid: 17. juni 2024