Takk for at du besøker Nature.com. Nettleserversjonen du bruker har begrenset CSS-støtte. For best resultat anbefaler vi at du bruker en nyere versjon av nettleseren din (eller deaktiverer kompatibilitetsmodus i Internet Explorer). I mellomtiden, for å sikre kontinuerlig støtte, viser vi nettstedet uten styling eller JavaScript.
Oppdagelsen og den nyttige bruken av naturprodukter kan bidra til å forbedre menneskers liv. Planteveksthemmende kjemikalier er mye brukt som herbicider for å bekjempe ugress. På grunn av behovet for å bruke forskjellige typer herbicider, er det behov for å identifisere forbindelser med nye virkningsmekanismer. I denne studien oppdaget vi en ny N-alkoksypyrrolforbindelse, kumamonamid, fra Streptomyces werraensis MK493-CF1 og etablerte den komplette synteseprosessen. Gjennom biologiske aktivitetsanalyser oppdaget vi at urs-monoaminsyre er et syntetisk mellomprodukt av urs-monoamid og et potensieltplanteveksthemmerI tillegg har vi utviklet ulike urbenonsyrederivater, inkludert urbenyloksyderivatet (UDA), som har høy herbicid aktivitet uten å påvirke veksten av HeLa-celler negativt. Vi fant også at urmotonsyrederivater forstyrrer plantemikrotubuli; i tillegg påvirker KAND aktinfilamenter og induserer celledød; Disse mangefasetterte effektene skiller seg fra de til kjente mikrotubuli-hemmere og antyder en ny virkningsmekanisme for ursonsyre, noe som representerer en viktig fordel i utviklingen av nye herbicider.
Oppdagelsen og den praktiske anvendelsen av gunstige naturprodukter og deres derivater er et middel for å forbedre menneskers livskvalitet. Sekundære metabolitter produsert av mikroorganismer, planter og insekter har ført til store fremskritt innen medisin og landbruk. Mange antibiotika og legemidler mot leukemi er utviklet fra naturprodukter. I tillegg finnes det ulike typerplantevernmidler, soppdrepende midler og herbicider utvinnes fra disse naturproduktene for bruk i landbruket. Spesielt er herbicider for ugressbekjempelse viktige verktøy for å øke avlingene i moderne landbruk, og ulike typer forbindelser brukes allerede kommersielt. Flere cellulære prosesser i planter, som fotosyntese, aminosyremetabolisme, celleveggsyntese, regulering av mitose, fytohormonsignalering eller proteinsyntese, regnes som typiske mål for herbicider. Forbindelser som hemmer mikrotubulifunksjonen er en vanlig klasse herbicider som påvirker plantevekst ved å påvirke mitotisk regulering.
Mikrotubuli er komponenter i cytoskjelettet og er i stor grad konservert i eukaryote celler. Tubulin-heterodimeren består av α-tubulin og β-tubulin som danner lineære mikrotubuli-protofilamenter, med 13 protofilamenter som danner en sylindrisk struktur. Mikrotubuli spiller flere roller i planteceller, inkludert å bestemme celleform, celledeling og intracellulær transport3,4. Planteceller inneholder mikrotubuli under interfase-plasmamembranen, og disse såkalte kortikale mikrotubuli antas å kontrollere organiseringen av cellulosemikrofibriller gjennom regulering av cellulosesyntasekomplekser4,5. Kortikale mikrotubuli i rotepidermalceller, som er tilstede i sonen med rask forlengelse av rotspissen, er plassert lateralt, og cellulosemikrofibre følger disse mikrotubuli og begrenser retningen på celleekspansjon, og fremmer dermed anisotropisk celleforlengelse. Derfor er mikrotubulifunksjonen nært knyttet til plantemorfologi. Aminosyresubstitusjoner i gener som koder for tubulin forårsaker skjevhet i kortikale mikrotubuli-arrays og venstre- eller høyresidig vekst i Arabidopsis 6,7. På samme måte kan mutasjoner i mikrotubuliassosierte proteiner som regulerer mikrotubulidynamikk også føre til forvrengt rotvekst 8,9,10,11,12,13. I tillegg forårsaker behandling med mikrotubuli-forstyrrende herbicider som disopyramid, også kjent som pretilaklor, også venstresidig skrå rotvekst 14. Disse dataene indikerer at presis regulering av mikrotubulifunksjonen er avgjørende for å bestemme retningen på plantens vekst.
Ulike typer mikrotubulihemmere har blitt oppdaget, og disse legemidlene har gitt betydelige bidrag til cytoskjelettforskning, så vel som til landbruk og medisin2. Spesielt oryzalin, dinitroanilinforbindelser, disopyramid, benzamidrelaterte forbindelser og deres analoger kan hemme mikrotubulifunksjonen og dermed hemme plantevekst. Derfor er de mye brukt som herbicider. Men siden mikrotubuli er en viktig komponent i plante- og dyreceller, er de fleste mikrotubulihemmere cytotoksiske for begge celletyper. Til tross for deres anerkjente nytteverdi som herbicider, brukes derfor et begrenset antall antimikrotubulimidler til praktiske formål.
Streptomyces er en slekt i familien Streptomyces, som inkluderer aerobe, gram-positive, filamentøse bakterier og er viden kjent for sin evne til å produsere et bredt spekter av sekundære metabolitter. Derfor regnes den som en av de viktigste kildene til nye biologisk aktive naturprodukter. I den nåværende studien oppdaget vi en ny forbindelse kalt kumamonamid, som ble isolert fra Streptomyces werraensis MK493-CF1 og S. werraensis ISP 5486. Ved hjelp av spektralanalyse og full spektralanalyse ble strukturen til kumamonamid karakterisert og dens unike N-alkoksypyrrolskjelett ble bestemt. Syntese. Ursmonsyre, et syntetisk mellomprodukt av ursmonoamid og dets derivater, ble funnet å hemme veksten og spiringen til den populære modellplanten Arabidopsis thaliana. I en struktur-aktivitetsforholdsstudie fant vi at en forbindelse med C9 modifisert til ursonsyre, kalt nonyloksyderivat av ursonsyre (KAND), forsterker den hemmende effekten på vekst og spiring betydelig. Det er verdt å merke seg at den nyoppdagede plantevekstehemmeren også påvirket veksten av tobakk og levermose, og ikke var cytotoksisk for bakterier eller HeLa-celler. Dessuten induserer noen urmotonsyrederivater en forvrengt rotfenotype, noe som antyder at disse derivatene direkte eller indirekte påvirker mikrotubuli. I samsvar med denne ideen indikerer våre observasjoner av mikrotubuli merket enten immunhistokjemisk eller med fluorescerende proteiner at KAND-behandling depolymeriserer mikrotubuli. I tillegg forstyrret behandling med kumamotonsyrederivater aktinmikrofilamenter. Dermed har vi oppdaget en ny plantevekstehemmer hvis unike virkningsmekanisme involverer ødeleggelse av cytoskjelettet.
Stamme MK493-CF1 ble isolert fra jord i Shinagawa-ku, Tokyo. Stamme MK493-CF1 dannet et godt forgrenet stromalt mycel. Delsekvensen til 16S ribosomalt RNA-gen (1422 bp) ble bestemt. Denne stammen er svært lik S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: typisk stamme, 99,93 %). Basert på dette resultatet ble det bestemt at denne stammen var nært beslektet med typestammen til S. werraensis. Derfor ga vi denne stammen foreløpig navnet S. werraensis MK493-CF1. S. werraensis ISP 5486T produserer også de samme bioaktive forbindelsene. Siden det var lite tidlig forskning på å utvinne naturlige produkter fra denne mikroorganismen, ble det utført ytterligere kjemisk forskning. Etter dyrking av S. werraensis MK493-CF1 på byggmedium ved fastfasefermentering ved 30 °C i 14 dager, ble mediet ekstrahert med 50 % EtOH. 60 ml av prøven ble tørket for å oppnå 59,5 mg råekstrakt. Råekstraktet ble utsatt for reversfase-HPLC for å gi N-metoksy-1H-pyrrol-2-karboksamid (1, kalt kumamonamid, 36,0 mg). Den totale mengden av 1 er omtrent 60 % av råekstraktet. Derfor bestemte vi oss for å studere egenskapene til kumamotoamid 1 i detalj.
Kumamonamid 1 er et hvitt amorft pulver, og høyoppløselig massespektrometri (HRESIMS) bekrefter C6H8N2O2 (fig. 1). Det C2-substituerte pyrrolfragmentet av denne forbindelsen er karakterisert ved δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH i 1H NMR-spektrum: 4,5 Hz, H-5) og δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), og 13C NMR-spekteret viser tilstedeværelsen av fire sp2-karbonatomer. Tilstedeværelsen av en amidgruppe i C2-posisjonen ble vurdert ved HMBC-korrelasjon fra C-3-protonet til amidkarbonylkarbonet ved δC 161,1. I tillegg indikerer 1H- og 13C-NMR-topper ved δH 4,10 (3H, S) og δC 68,3 tilstedeværelsen av N-metoksygrupper i molekylet. Selv om den korrekte posisjonen til metoksygruppen ennå ikke var bestemt ved hjelp av spektroskopisk analyse som forbedret differansespektroskopi og nukleær Overhauser-forkortelse (NOEDF), ble N-metoksy-1H-pyrrol-2-karboksamid den første kandidatforbindelsen.
For å bestemme den korrekte strukturen til 1 ble det utført en totalsyntese (fig. 2a). Behandling av kommersielt tilgjengelig 2-aminopyridin 2 med m-CPBA resulterte i det tilsvarende N-oksidet 3 i kvantitativt utbytte. Etter 2-aminoazideringen av 2 ble syklokondensasjonsreaksjonen beskrevet av Abramovich utført i benzen ved 90 °C for å oppnå den ønskede 1-hydroksy-1H-pyrrol-2-karbonitril 5 i gram. Hastighet 60 % (to trinn). 15,16. Metylering og hydrolyse av 4 ga deretter 1-metoksy-1H-pyrrol-2-karboksylsyre (kalt "kumotonsyre", 6) i godt utbytte (70 %, to trinn). Til slutt ga amidering via syreklorid-mellomprodukt 6 ved bruk av vandig ammoniakk Kumamoto-amid 1 i 98 % utbytte. Alle spektraldata for syntetisert 1 var lik de for isolert 1, så strukturen til 1 ble bestemt;
Generell syntese og analyse av den biologiske aktiviteten til urbenamid og urbensyre. (a) Totalsyntese av Kumamoto-amid. (b) Syv dager gamle villtype Arabidopsis Columbia (Col)-frøplanter ble dyrket på Murashige og Skoog (MS)-plater som inneholdt kumamonamid 6 eller kumamonamid 1 i de angitte konsentrasjonene. Målestokk = 1 cm.
Først vurderte vi de biologiske aktivitetene til urbenamid og dets mellomprodukter for deres evne til å modulere plantevekst. Vi tilsatte forskjellige konsentrasjoner av ursmonamid 1 eller ursonsyre 6 til MS agarmedium og dyrket Arabidopsis thaliana-frøplanter på dette mediet. Disse analysene viste at høye konsentrasjoner (500 μM) av 6 hemmet rotvekst (fig. 2b). Deretter genererte vi forskjellige derivater ved å erstatte N1-posisjonen til 6 og utførte struktur-aktivitetsforholdsstudier på dem (analogsynteseprosessen er beskrevet i tilleggsinformasjonen (SI)). Arabidopsis-frøplanter ble dyrket på et medium som inneholdt 50 μM ursonsyrederivater, og rotlengden ble målt, som vist på bildet. Som vist i figur 3a, b og S1, har kumamosyrer forskjellige lengder av lineære alkoksykjeder (9, 10, 11, 12 og 13) eller store alkoksykjeder (15, 16 og 17) i N1-posisjonen. Derivatene viste signifikant hemming av rotvekst. I tillegg fant vi at påføring av 200 μM 10, 11 eller 17 hemmet spiring (fig. 3c og S2).
Studie av struktur-aktivitetsforholdet til Kumamoto-amid og relaterte forbindelser. (a) Struktur- og synteseskjema for analoger. (b) Kvantifisering av rotlengde til 7 dager gamle frøplanter dyrket på MS-medium med eller uten 50 μM kumamonamidderivater. Stjerner indikerer signifikante forskjeller med simulert behandling (t-test, p< 0,05). n>18. Data vises som gjennomsnitt ± SD. nt betyr «ikke testet» fordi mer enn 50 % av frøene ikke spirte. (c) Kvantifisering av spirehastighet for behandlede frø inkubert i 7 dager i MS-medium med eller uten 200 μM kumamonamid og relaterte forbindelser. Stjerner indikerer signifikante forskjeller med simulert behandling (kji-kvadrattest). n=96.
Interessant nok reduserte tilsetningen av alkyl-sidekjeder lengre enn C9 den hemmende aktiviteten, noe som tyder på at kumamotosyrerelaterte forbindelser krever sidekjeder av en viss størrelse for å utvise sin biologiske aktivitet.
Fordi struktur-aktivitetsforholdsanalyse viste at C9 var modifisert til ursonsyre og nonyloksyderivatet av ursonsyre (heretter referert til som KAND 11) var den mest effektive planteveksthemmeren, utførte vi en mer detaljert karakterisering av KAND 11. Behandling av Arabidopsis med 50 μM KAND 11 forhindret nesten fullstendig spiring, mens lavere konsentrasjoner (40, 30, 20 eller 10 μM) av KAND 11 hemmet rotvekst på en doseavhengig måte (fig. 4a, b). For å teste om KAND 11 påvirker rotmeristemets levedyktighet, undersøkte vi rotmeristemer farget med propidiumjodid (PI) og målte meristemets arealstørrelse. Størrelsen på meristemet til frøplanter dyrket på et medium som inneholdt 25 μM KAND-11 var 151,1 ± 32,5 μm, mens størrelsen på meristemet til frøplanter dyrket på et kontrollmedium som inneholdt DMSO var 264,7 ± 30,8 μm (fig. 4c, d), noe som indikerer at KAND-11 gjenoppretter cellulær aktivitet. Rotmeristem. I samsvar med dette reduserte KAND 11-behandling mengden av celledelingsmarkøren CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS-signal i rotmeristemet (fig. 4e)17. Disse resultatene indikerer at KAND 11 hemmer rotvekst ved å redusere celleproliferasjonsaktivitet.
Analyse av den hemmende effekten av urbenonsyrederivater (urbenyloksyderivater) på vekst. (a) 7 dager gamle villtype Col-frøplanter dyrket på MS-plater med de angitte konsentrasjonene av KAND 11. Skala = 1 cm. (b) Kvantifisering av rotlengde. Bokstaver indikerer signifikante forskjeller (Tukey HSD-test, p< 0,05). n>16. Data vises som gjennomsnitt ± SD. (c) Konfokalmikroskopi av propidiumjodid-fargede villtype Col-røtter dyrket på MS-plater med eller uten 25 μM KAND 11. Hvite parenteser indikerer rotmeristem. Skala = 100 µm. (d) Kvantifisering av rotmeristemstørrelse (n = 10 til 11). Statistiske forskjeller ble bestemt ved hjelp av t-test (p< 0,05). Stolpene representerer den gjennomsnittlige meristemstørrelsen. (e) Differensiell interferenskontrast (DIC)-mikroskopi av et rotmeristem som inneholder CDKB2-konstruksjonen; 1pro: CDKB2; 1-GUS farget og farget på 5 dager gamle frøplanter dyrket på MS-plater med eller uten 25 µM KAND-analyse.
Fytotoksisiteten til KAND 11 ble videre testet ved bruk av en annen tokimbladet plante, tobakk (Nicotiana tabacum), og en viktig modellorganisme for landplanter, levermose (Marchantia polymorpha). Som i tilfellet med Arabidopsis, produserte tobakk SR-1-frøplanter dyrket på medium som inneholdt 25 μM KAND 11 kortere røtter (fig. 5a). I tillegg spirte 40 av 48 frø på plater som inneholdt 200 μM KAND 11, mens alle 48 frø spirte på simulert behandlet medium, noe som indikerer at høyere konsentrasjoner av KAND var signifikante (p< 0,05; chi-test -kvadrat) hemmet spiringen av tobakk. (Fig. 5b). I tillegg var konsentrasjonen av KAND 11 som hemmet bakterievekst i levermose lik den effektive konsentrasjonen i Arabidopsis (Fig. 5c). Disse resultatene indikerer at KAND 11 kan hemme veksten til en rekke planter. Vi undersøkte deretter mulig cytotoksisitet av bjørnemonoamidrelaterte forbindelser i andre organismer, nemlig humane HeLa-celler og Escherichia coli-stammen DH5α, som representanter for henholdsvis høyere dyre- og bakterieceller. I en serie celleproliferasjonsanalyser observerte vi at kumamonamid 1, kumamonamidsyre 6 og KAND 11 ikke påvirket veksten av HeLa- eller E. coli-celler ved konsentrasjoner på 100 μM (Fig. 5d,e).
Veksthemming av KAND 11 i ikke-Arabidopsis-organismer. (a) To uker gamle villtype SR-1 tobakksplanter ble dyrket på vertikalt plasserte MS-plater som inneholdt 25 μM KAND 11. (b) To uker gamle villtype SR-1 tobakksplanter ble dyrket på horisontalt plasserte MS-plater som inneholdt 200 μM KAND 11. (c) To uker gamle villtype Tak-1 levermossknopper dyrket på Gamborg B5-plater med de angitte konsentrasjonene av KAND 11. Røde piler indikerer sporer som sluttet å vokse innen den to uker lange inkubasjonsperioden. (d) Celleproliferasjonsanalyse av HeLa-celler. Antall levedyktige celler ble målt med faste tidsintervaller ved bruk av et celletellingskit 8 (Dojindo). Som kontroll ble HeLa-celler behandlet med 5 μg/ml aktinomycin D (Act D), som hemmer RNA-polymerase-transkripsjon og forårsaker celledød. Analysene ble utført i tre eksemplarer. (e) E. coli celleproliferasjonsanalyse. E. coli-vekst ble analysert ved å måle OD600. Som kontroll ble cellene behandlet med 50 μg/ml ampicillin (Amp), som hemmer syntesen av bakteriell cellevegg. Analysene ble utført i tre eksemplarer.
For å tyde virkningsmekanismen til cytotoksisitet forårsaket av uramidrelaterte forbindelser, analyserte vi urbensyrederivater med moderate hemmende effekter på nytt, som vist på bildet. Som vist i figur 2b og 6a, produserte frøplanter dyrket på agarplater som inneholdt høye konsentrasjoner (200 μM) urmotonsyre 6 kortere og venstrebøyde røtter (θ = – 23,7 ± 6,1), mens frøplantene dyrket på kontrollmediet produserte nesten rette røtter (θ = – 3,8 ± 7,1). Denne karakteristiske skrå veksten er kjent for å skyldes dysfunksjon av kortikale mikrotubuli 14,18. I samsvar med dette funnet induserte de mikrotubuli-destabiliserende legemidlene disopyramid og oryzalin lignende rotvipping under våre vekstforhold (figur 2b og 6a). Samtidig testet vi urmotonsyrederivater og valgte ut flere av dem som ved visse konsentrasjoner induserte skrå rotvekst. Forbindelsene 8, 9 og 15 endret rotvekstretningen ved henholdsvis 75 μM, 50 μM og 40 μM, noe som indikerer at disse forbindelsene effektivt kan destabilisere mikrotubuli (fig. 2b, 6a). Vi testet også det mest potente ursolsyrederivatet, KAND 11, ved en lavere konsentrasjon (15 μM) og fant at påføring av KAND 11 hemmet rotvekst og at rotvekstretningen var ujevn, selv om de hadde en tendens til å helle mot venstre (figur C3). Fordi høyere konsentrasjoner av mikrotubuli-destabiliserende legemidler noen ganger hemmer plantevekst i stedet for å forårsake rotvipping, vurderte vi deretter muligheten for at KAND 11 påvirker mikrotubuli ved å observere kortikale mikrotubuli i rotens epidermale celler. Immunhistokjemi ved bruk av anti-β-tubulin-antistoffer i epidermale celler fra frøplanterøtter behandlet med 25 μM KAND 11 viste forsvinningen av nesten alle kortikale mikrotubuli i epidermale celler i forlengelsessonen (fig. 6b). Disse resultatene indikerer at kumamotonsyre og dens derivater virker direkte eller indirekte på mikrotubuli for å forstyrre dem, og at disse forbindelsene er nye mikrotubuli-hemmere.
Ursonsyre og dens derivater endrer kortikale mikrotubuli i Arabidopsis thaliana. (a) Rothellingsvinkel målt i nærvær av forskjellige urmonsyrederivater ved de angitte konsentrasjonene. Effektene av to forbindelser kjent for å hemme mikrotubuli: disopyramid og oryzalin ble også analysert. Innsettet viser standarden som brukes til å måle rotvekstvinkel. Stjerner indikerer signifikante forskjeller med simulert behandling (t-test, p< 0,05). n>19. Målestokk = 1 cm. (b) Kortikale mikrotubuli i epidermale celler i forlengelsessonen. Mikrotubuli i villtype Arabidopsis Col-røtter dyrket på MS-plater med eller uten 25 μM KAND 11 ble visualisert ved immunhistokjemisk farging ved bruk av primære β-tubulin-antistoffer og Alexa Fluor-konjugerte sekundære antistoffer. Målestokk = 10 µm. (c) Mitotisk struktur av mikrotubuli i rotmeristemet. Mikrotubuli ble visualisert ved bruk av immunhistokjemisk farging. Mitotisk struktur, inkludert profasesoner, spindler og fragmoplaster, ble telt fra konfokale bilder. Piler indikerer mitotiske mikrotubulistrukturer. Stjerner indikerer signifikante forskjeller med simulert behandling (t-test, p< 0,05). n>9. Målestokk = 50 µm.
Selv om Ursa har evnen til å forstyrre mikrotubulifunksjonen, forventes virkningsmekanismen å være forskjellig fra typiske mikrotubuli-depolymeriserende midler. For eksempel induserer høyere konsentrasjoner av mikrotubuli-depolymeriserende midler som disopyramid og oryzalin anisotropisk ekspansjon av epidermale celler, mens KAND 11 ikke gjør det. I tillegg resulterte samtidig bruk av KAND 11 og disopyramid i en kombinert disopyramidindusert rotvekstrespons, og KAND 11-indusert veksthemming ble observert (fig. S4). Vi analyserte også responsen til den overfølsomme disopyramid 1-1 (phs1-1)-mutanten på KAND 11. phs1-1 har en ikke-kanonisk tubulinkinasepunktmutasjon og produserer kortere røtter når den behandles med disopyramid9,20. phs1-1-mutantfrøplanter dyrket på agarmedium som inneholdt KAND 11 hadde kortere røtter som ligner på de som ble dyrket på disopyramid (fig. S5).
I tillegg observerte vi mitotiske mikrotubulistrukturer, som profasesoner, spindler og fragmoplaster, i rotmeristemet til frøplanter behandlet med KAND 11. I samsvar med observasjonene for CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS ble det observert en signifikant reduksjon i antall mitotiske mikrotubuli (fig. 6c).
For å karakterisere cytotoksisiteten til KAND 11 ved subcellulær oppløsning, behandlet vi tobakks BY-2-suspensjonsceller med KAND 11 og observerte deres respons. Vi tilsatte først KAND 11 til BY-2-celler som uttrykker TagRFP-TUA6, som fluorescerende merker mikrotubuli, for å vurdere effekten av KAND 11 på kortikale mikrotubuli. Kortikal mikrotubulitettthet ble vurdert ved hjelp av bildeanalyse, som kvantifiserte prosentandelen cytoskjelettpiksler blant cytoplasmatiske piksler. Analyseresultatene viste at etter behandling med 50 μM eller 100 μM KAND 11 i 1 time, sank tettheten betydelig til henholdsvis 0,94 ± 0,74 % eller 0,23 ± 0,28 %, mens tettheten av celler behandlet med DMSO utgjorde 1,61 ± 0,34 % (fig. 7a). Disse resultatene er i samsvar med observasjonen i Arabidopsis om at KAND 11-behandling induserer depolymerisering av kortikale mikrotubuli (fig. 6b). Vi undersøkte også BY-2-linjen med GFP-ABD-merkede aktinfilamenter etter behandling med samme konsentrasjon av KAND 11 og observerte at KAND 11-behandling forstyrret aktinfilamentene. Behandling med 50 μM eller 100 μM KAND 11 i 1 time reduserte aktinfilamenttettheten betydelig til henholdsvis 1,20 ± 0,62 % eller 0,61 ± 0,26 %, mens tettheten i DMSO-behandlede celler var 1,69 ± 0,51 % (fig. 2). 7b). Disse resultatene står i kontrast til effektene av propyzamid, som ikke påvirker aktinfilamenter, og latrunculin B, en aktin-depolymerisator som ikke påvirker mikrotubuli (SI figur S6). I tillegg påvirket ikke behandling med kumamonamid 1, kumamonamidsyre 6 eller KAND 11 mikrotubuli i HeLa-celler (SI figur S7). Dermed antas virkningsmekanismen til KAND 11 å være forskjellig fra den til kjente cytoskjelettforstyrrere. I tillegg avslørte vår mikroskopiske observasjon av BY-2-celler behandlet med KAND 11 starten på celledød under KAND 11-behandling og viste at andelen Evans-blåfargede døde celler ikke økte signifikant etter 30 minutters KAND 11-behandling, mens antallet døde celler økte til henholdsvis 43,7 % eller 80,1 % etter 90 minutters behandling med 50 μM eller 100 μM KAND (fig. 7c). Samlet sett indikerer disse dataene at det nye ursolsyrederivatet KAND 11 er en plantespesifikk cytoskjeletthemmer med en tidligere ukjent virkningsmekanisme.
KAND påvirker kortikale mikrotubuli, aktinfilamenter og levedyktigheten til tobakks BY-2-celler. (a) Visualisering av kortikale mikrotubuli i BY-2-celler i nærvær av TagRFP-TUA6. BY-2-celler behandlet med KAND 11 (50 μM eller 100 μM) eller DMSO ble undersøkt ved konfokalmikroskopi. Kortikal mikrotubulitettthet ble beregnet fra mikrografer av 25 uavhengige celler. Bokstaver indikerer signifikante forskjeller (Tukey HSD-test, p< 0,05). Skala = 10 µm. (b) Kortikale aktinfilamenter i BY-2-celler visualisert i nærvær av GFP-ABD2. BY-2-celler behandlet med KAND 11 (50 μM eller 100 μM) eller DMSO ble undersøkt ved konfokalmikroskopi. Tettheten av kortikale aktinfilamenter ble beregnet fra mikrografer av 25 uavhengige celler. Bokstaver indikerer signifikante forskjeller (Tukey HSD-test, p< 0,05). Skala = 10 µm. (c) Observasjon av døde BY-2-celler ved Evans blåfarging. BY-2-celler behandlet med KAND 11 (50 μM eller 100 μM) eller DMSO ble undersøkt ved lysfeltmikroskopi. n=3. Skala = 100 µm.
Oppdagelsen og anvendelsen av nye naturprodukter har ført til betydelige fremskritt innen ulike aspekter av menneskelivet, inkludert medisin og landbruk. Historisk forskning har blitt utført for å utvinne nyttige forbindelser fra naturressurser. Spesielt er aktinomyceter kjent for å være nyttige som antiparasittiske antibiotika for nematoder på grunn av deres evne til å produsere ulike sekundære metabolitter som avermektin, hovedforbindelsen i ivermektin og bleomycin og dets derivater, brukt medisinsk som et antikreftmiddel21,22. På samme måte har en rekke herbicide forbindelser blitt oppdaget fra aktinomyceter, hvorav noen allerede brukes kommersielt1,23. Derfor anses analysen av aktinomycet-metabolitter for å isolere naturprodukter med ønskede biologiske aktiviteter som en effektiv strategi. I denne studien oppdaget vi en ny forbindelse, kumamonamid, fra S. werraensis og syntetiserte den med hell. Ursonsyre er et syntetisk mellomprodukt av urbenamid og dets derivater. Det kan forårsake karakteristisk rotkrølling, utvise moderat til sterk herbicid aktivitet og direkte eller indirekte skade plantemikrotubuli. Virkningsmekanismen til urmotonsyre kan imidlertid avvike fra den til eksisterende mikrotubulihemmere, siden KAND 11 også forstyrrer aktinfilamenter og forårsaker celledød, noe som tyder på en reguleringsmekanisme der urmotonsyre og dens derivater påvirker et bredt spekter av cytoskjelettstrukturer.
Ytterligere detaljert karakterisering av urbenonsyre vil bidra til å bedre forstå virkningsmekanismen til urbenonsyre. Spesielt er det neste målet å evaluere ursonsyrens evne til å binde seg til reduserte mikrotubuli for å avgjøre om ursonsyre og dens derivater virker direkte på mikrotubuli og depolymeriserer dem, eller om virkningen deres resulterer i destabilisering av mikrotubuli. I tillegg, i tilfeller der mikrotubuli ikke er et direkte mål, vil identifisering av virkningsstedet og molekylære mål for ursonsyre på planteceller bidra til å forstå egenskapene til beslektede forbindelser og mulige måter å forbedre herbicidaktiviteten på. Vår bioaktivitetsanalyse avdekket den unike cytotoksiske evnen til ursonsyre på veksten av planter som Arabidopsis thaliana, tobakk og levermoss, mens verken E. coli eller HeLa-celler ble påvirket. Liten eller ingen toksisitet for dyreceller er en fordel med ursonsyrederivater hvis de utvikles som herbicider for bruk i åpne jordbruksfelt. Faktisk, siden mikrotubuli er vanlige strukturer i eukaryoter, er deres selektive hemming i planter et sentralt krav for herbicider. For eksempel brukes propyzamid, et mikrotubuli-depolymeriserende middel som binder seg direkte til tubulin og hemmer polymerisering, som et herbicid på grunn av dets lave toksisitet for dyreceller24. I motsetning til disopyramid har beslektede benzamider forskjellige målspesifisiteter. I tillegg til plantemikrotubuli hemmer RH-4032 eller benzoksamid også mikrotubuli i henholdsvis dyreceller eller oomyceter, og zalilamid brukes som et soppdrepende middel på grunn av dets lave fytotoksisitet25,26,27. Den nyoppdagede bjørnen og dens derivater viser selektiv cytotoksisitet mot planter, men det er verdt å merke seg at ytterligere modifikasjoner kan endre deres målspesifisitet, potensielt gi ytterligere derivater for kontroll av patogene sopp eller oomyceter.
De unike egenskapene til urbenonsyre og dens derivater er nyttige for deres utvikling som herbicider og bruk som forskningsverktøy. Cytoskjelettets betydning for å kontrollere plantecelleform er allment anerkjent. Tidligere studier har vist at planter har utviklet komplekse mekanismer for organisering av kortikale mikrotubuli ved å kontrollere mikrotubulidynamikk for å kontrollere morfogenese på riktig måte. Et stort antall molekyler som er ansvarlige for reguleringen av mikrotubuliaktivitet har blitt identifisert, og relatert forskning pågår fortsatt3,4,28. Vår nåværende forståelse av mikrotubulidynamikk i planteceller forklarer ikke fullt ut mekanismene for organisering av kortikale mikrotubuli. For eksempel, selv om både disopyramid og oryzalin kan depolymerisere mikrotubuli, forårsaker disopyramid alvorlig rotforvrengning, mens oryzalin har en relativt mild effekt. Dessuten forårsaker mutasjoner i tubulin, som stabiliserer mikrotubuli, også dekstrorotasjon i røtter, mens paklitaksel, som også stabiliserer mikrotubulidynamikk, ikke gjør det. Derfor bør studier og identifisering av de molekylære målene for ursolsyre gi ny innsikt i reguleringen av plantekortikale mikrotubuli. På samme måte vil fremtidige sammenligninger av kjemikalier som er effektive for å fremme forvrengt vekst, som disopyramid, og mindre effektive kjemikalier, som oryzalin eller kumamotorsyre, gi ledetråder til hvordan forvrengt vekst oppstår.
På den annen side er forsvarsrelaterte cytoskjelett-omorganiseringer en annen mulighet for å forklare cytotoksisiteten til ursonsyre. Infeksjon av et patogen eller introduksjon av en elicitor i planteceller forårsaker noen ganger ødeleggelse av cytoskjelettet og påfølgende celledød29. For eksempel er det rapportert at oomycet-avledet kryptoksantin forstyrrer mikrotubuli og aktinfilamenter før tobakkscelledød, likt det som skjer med KAND-behandling30,31. Likhetene mellom forsvarsresponser og cellulære responser indusert av ursonsyre førte til at vi antok at de utløser vanlige cellulære prosesser, selv om en raskere og sterkere effekt av ursonsyre enn kryptoksantin er tydelig. Studier har imidlertid vist at forstyrrelse av aktinfilamenter fremmer spontan celledød, som ikke alltid er ledsaget av mikrotubuli-forstyrrelse29. I tillegg gjenstår det å se om enten patogenet eller elicitoren forårsaker forvrengt rotvekst, slik ursonsyrederivater gjør. Dermed er molekylær kunnskap som knytter forsvarsresponser og cytoskjelettet et attraktivt problem å ta opp. Ved å utnytte tilstedeværelsen av lavmolekylære forbindelser relatert til ursonsyre, samt en rekke derivater med varierende potens, kan de gi muligheter til å målrette ukjente cellulære mekanismer.
Samlet sett vil oppdagelsen og anvendelsen av nye forbindelser som modulerer mikrotubuli-dynamikk gi kraftige metoder for å adressere de komplekse molekylære mekanismene som ligger til grunn for bestemmelse av plantecellers form. I denne sammenhengen kan den nylig utviklede forbindelsen urmotonsyre, som påvirker mikrotubuli og aktinfilamenter og induserer celledød, gi en mulighet til å tyde sammenhengen mellom mikrotubuli-kontroll og disse andre mekanismene. Dermed vil kjemisk og biologisk analyse ved bruk av urbenonsyre hjelpe oss å forstå de molekylære reguleringsmekanismene som kontrollerer plantens cytoskjelett.
Inokuler S. werraensis MK493-CF1 i en 500 ml Erlenmeyer-kolbe med baffel som inneholder 110 ml såmedium bestående av 2 % (w/v) galaktose, 2 % (w/v) essenspasta, 1 % (w/v) Bacto-sammensetning. -soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5 % (w/v) maisekstrakt (KOGOSTCH Co., Ltd., Japan), 0,2 % (w/v) (NH4)2SO4 og 0,2 % CaCO3 i avionisert vann (pH 7,4 før sterilisering). Frøkulturene ble inkubert på en rotasjonsrister (180 rpm) ved 27 °C i 2 dager. Produksjonsdyrking via faststofffermentering. Frøkulturen (7 ml) ble overført til en 500 ml K-1-kolbe som inneholdt 40 g produksjonsmedium bestående av 15 g presset bygg (MUSO Co., Ltd., Japan) og 25 g avionisert vann (pH ikke justert før sterilisering). Fermenteringen ble utført ved 30 °C i mørket i 14 dager. Fermenteringsmaterialet ble ekstrahert med 40 ml EtOH per flaske og sentrifugert (1500 g, 4 °C, 10 min). Kultursupernatanten (60 ml) ble ekstrahert med en blanding av 10 % MeOH/EtOAc. Det organiske laget ble inndampet under redusert trykk for å oppnå et residuum (59,5 mg), som ble utsatt for HPLC med gradienteluering (0–10 minutter: 90 %) på en reversfasekolonne (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × lengde 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minutter: 90 % H2O/CH3CN til 70 % H2O/CH3CN (gradient), 35–45 minutter: 90 % H2O/EtOH, 45–155 minutter: 90 % H2O/EtOH til 100 % EtOH (gradient, 155–200 min: 100 % EtOH) ved en strømningshastighet på 1,5 ml/min. Kumamonamid (1, 36,0 mg) ble isolert som et hvitt amorft pulver.
Kumamotoamid(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz, 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H), 4,08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ beregnet verdi: 141,0659, målt verdi: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Columbia-frø (Col-0) ble innhentet fra Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) med tillatelse til forskningsbruk. Col-0-frø ble formert og vedlikeholdt under våre laboratorieforhold og brukt som villtype Arabidopsis-planter. Arabidopsis-frø ble overflatesterilisert og dyrket i halvstyrke Murashige og Skoog-medium som inneholdt 2 % sukrose (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05 % (w/v) 2-(4-morfolino)etansulfonsyre (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) og 1,5 % agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, ved 23 °C og konstant lys. Frø av phs1-1-mutanten ble levert av T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology).
Frø av stammen SR-1 ble levert av T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) og brukt som villtype tobakksplanter. Tobakksfrøene ble overflatesterilisert og bløtlagt i sterilt vann i tre netter for å fremme spiring, deretter plassert i en halvstyrkeløsning som inneholdt 2 % sukrose, 0,05 % (w/v) MES og 0,8 % gellangummi (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige og Skoog-medium) med pH 5,7 og inkubert ved 23 °C under konstant lys.
Stamme Tak-1 ble levert av T. Kohchi (Kyoto University) og ble brukt som standard eksperimentell enhet for levermoststudien. Gemma ble hentet fra steriliserte dyrkede planter og deretter platet ut på Gamborg B5-medium (Fujifilm Wako Pure Chemical) som inneholdt 1 % sukrose og 0,3 % gellangummi og inkubert ved 23 °C under kontinuerlig lys.
Tobakks-BY-2-celler (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) ble levert av S. Hasezawa (Universitetet i Tokyo). BY-2-celler ble fortynnet 95 ganger i modifisert Linsmeier- og Skoog-medium og supplert ukentlig med 2,4-diklorfenoksyeddiksyre 32. Cellesuspensjonen ble blandet på en rotasjonsrister ved 130 rpm ved 27 °C i mørket. Vask cellene med 10 ganger volumet av ferskt medium og resuspender i samme medium. BY-2-transgene cellelinjer som stabilt uttrykker mikrotubuli-markøren TagRFP-TUA6 eller aktinfilamentmarkøren GFP-ABD2 under blomkålmosaikkvirus 35S-promotoren ble generert som beskrevet 33, 34, 35. Disse cellelinjene kan vedlikeholdes og synkroniseres ved hjelp av prosedyrer som ligner på de som ble brukt for den opprinnelige BY-2-cellelinjen.
HeLa-celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) (Life Technologies) tilsatt 10 % føtalt bovint serum, 1,2 U/ml penicillin og 1,2 μg/ml streptomycin i en 37 °C inkubator med 5 % CO2.
Alle eksperimentene beskrevet i dette manuskriptet ble utført i samsvar med japanske biosikkerhetsforskrifter og retningslinjer.
Forbindelsene ble løst opp i dimetylsulfoksid (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) som stamløsninger og fortynnet i MS-medium for Arabidopsis og tobakk eller Gamborg B5-medium for levermost. For rotvekstinhiberingsanalysen ble mer enn 10 frø per plate sådd på agarmedium som inneholdt de angitte forbindelsene eller DMSO. Frøene ble inkubert i et vekstkammer i 7 dager. Frøplantene ble fotografert og lengden på røttene ble målt. For Arabidopsis-spiringsanalysen ble 48 frø per plate sådd på agarmedium som inneholdt 200 μM forbindelse eller DMSO. Arabidopsis-frø ble dyrket i et vekstkammer, og antallet spirede frøplanter ble telt 7 dager etter spiring (dag). For tobakksspiringsanalysen ble 24 frø per plate sådd på agarmedium som inneholdt 200 μM KAND eller DMSO. Tobakksfrø ble dyrket i et vekstkammer, og antallet spirede frøplanter ble telt etter 14 dager. For vekstinhiberingsanalysen av levermost ble 9 embryoer fra hver plate plassert på agarmedium som inneholdt de angitte konsentrasjonene av KAND eller DMSO og inkubert i et vekstkammer i 14 dager.
Bruk frøplanter farget med 5 mg/ml propidiumjodid (PI) for å visualisere rotmeristemorganiseringen. PI-signaler ble observert ved fluorescensmikroskopi ved bruk av et TCS SPE konfokalt laserskanningsmikroskop (Leica Microsystems).
Histokjemisk farging av røtter med β-glukuronidase (GUS) ble utført i henhold til protokollen beskrevet av Malami og Benfey36. Frøplantene ble fiksert i 90 % aceton over natten, farget med 0,5 mg/ml 5-brom-4-klor-3-indolyl-β-d-glukuronsyre i GUS-buffer i 1 time og plassert i en hydrert kloraldehydløsning (8 g kloralhydrat, 2 ml vann og 1 ml glyserol) og observert ved differensiell interferenskontrastmikroskopi ved bruk av et Axio Imager M1-mikroskop (Carl Zeiss).
Rotvinklene ble målt på 7 dager gamle frøplanter dyrket på vertikalt plasserte plater. Mål rotvinkelen fra retningen til gravitasjonsvektoren som beskrevet i trinn 6.
Arrangementet av kortikale mikrotubuli ble observert som beskrevet, med mindre modifikasjoner i protokollen 37. Anti-β-tubulin-antistoff (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) og Alexa Fluor 488-konjugert anti-mus IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) ble brukt som primære og sekundære antistoffer ved henholdsvis 1:1000 og 1:100 fortynninger. Fluorescensbilder ble tatt ved hjelp av et TCS SPE konfokalt laserskanningsmikroskop (Leica Microsystems). Ta Z-stack-bilder og lag projeksjoner med maksimal intensitet i henhold til produsentens instruksjoner.
HeLa-celleproliferasjonsanalyse ble utført ved bruk av Cell Counting Kit 8 (Dojindo) i henhold til produsentens instruksjoner.
Veksten av E. coli DH5α ble analysert ved å måle celletetthet i kultur ved bruk av et spektrofotometer ved 600 nm (OD600).
Cytoskjelettorganisering i transgene BY-2-celler ble observert ved bruk av et fluorescensmikroskop utstyrt med en CSU-X1 konfokal skanningsenhet (Yokogawa) og et sCMOS-kamera (Zyla, Andor Technology). Cytoskjeletttetthet ble vurdert ved bildeanalyse, som kvantifiserte prosentandelen cytoskjelettpiksler blant cytoplasmatiske piksler i konfokale bilder ved bruk av ImageJ-programvare som beskrevet38,39.
For å oppdage celledød i BY-2-celler ble en alikvot av cellesuspensjonen inkubert med 0,05 % Evans-blått i 10 minutter ved romtemperatur. Selektiv Evans-blåttfarging av døde celler avhenger av ekstrudering av fargestoffet fra levedyktige celler av den intakte plasmamembranen40. Fargede celler ble observert ved hjelp av et lysfeltmikroskop (BX53, Olympus).
HeLa-celler ble dyrket i DMEM tilsatt 10 % FBS i en fuktet inkubator ved 37 °C og 5 % CO2. Cellene ble behandlet med 100 μM KAND 11, kumamonaminsyre 6, kumamonamid 1, 100 ng/ml kolcemid (Gibco) eller 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) i 6 timer ved 37 °C. Cellene ble fiksert med MetOH i 10 minutter og deretter med acetat i 5 minutter ved romtemperatur. Fikserte celler ble inkubert med β-tubulin primært antistoff (1D4A4, Proteintech: 66240-1) fortynnet i 0,5 % BSA/PBS i 2 timer, vasket 3 ganger med TBST og deretter inkubert med Alexa Fluor geiteantistoff. 488 1 time. – Mus-IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) og 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) fortynnet i 0,5 % BSA/PBS. Etter tre gangers vask med TBST ble fargede celler observert på et Nikon Eclipse Ti-E invertert mikroskop. Bildene ble tatt med et avkjølt Hamamatsu ORCA-R2 CCD-kamera ved bruk av MetaMorph-programvare (Molecular Devices).
Publisert: 17. juni 2024