Furunematoden er en karantenemigrerende endoparasitt kjent for å forårsake alvorlige økonomiske tap i furuskogøkosystemer. Denne studien gjennomgår den nematicidale aktiviteten til halogenerte indoler mot furunematoder og deres virkningsmekanisme. Den nematicidale aktiviteten til 5-jodoindol og avermektin (positiv kontroll) mot furunematoder var lik og høy ved lave konsentrasjoner (10 μg/ml). 5-jodoindol reduserte fruktbarhet, reproduksjonsaktivitet, embryonal og larvedødelighet og lokomotorisk atferd. Molekylære interaksjoner mellom ligander og virvelløsespesifikke glutamatstyrte kloridkanalreseptorer støtter antagelsen om at 5-jodoindol, i likhet med avermektin, binder seg tett til reseptorens aktive sted. 5-jodoindol induserte også ulike fenotypiske deformasjoner i nematoder, inkludert unormal organkollaps/krymping og økt vakuolisering. Disse resultatene tyder på at vakuoler kan spille en rolle i nematodemetyleringsmediert død. Det er viktig å merke seg at 5-jodoindol ikke var giftig for noen av planteartene (kål og reddik). Denne studien viser dermed at bruk av jodoindol under miljøforhold kan kontrollere visneskader fra furu.
Furunematoden (Bursaphelenchus xylophilus) tilhører furunematodene (PWN), migrerende endoparasittiske nematoder som er kjent for å forårsake alvorlig økologisk skade på furuskogøkosystemer1. Visnesyke (PWD) forårsaket av furunematoden er i ferd med å bli et alvorlig problem på flere kontinenter, inkludert Asia og Europa, og i Nord-Amerika ødelegger nematoden introduserte furuarter1,2. Nedgang i furutrær er et stort økonomisk problem, og utsiktene til global spredning er bekymringsfulle3. Følgende furuarter angripes oftest av nematoden: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii og Pinus radiata4. Furunematode er en alvorlig sykdom som kan drepe furutrær innen uker eller måneder etter infeksjon. I tillegg er utbrudd av furunematoder vanlige i en rekke økosystemer, så vedvarende infeksjonskjeder har blitt etablert1.
Bursaphelenchus xylophilus er en karantene planteparasittisk nematode som tilhører superfamilien Aphelenchoidea og kladen 102.5. Nematoden lever av sopp og formerer seg i vedvevet til furutrær, og utvikler seg til fire forskjellige larvestadier: L1, L2, L3, L4 og et voksent individ1,6. Under forhold med matmangel går furunematoden over i et spesialisert larvestadium – dauer, som parasiterer vektoren sin – furubarkbillen (Monochamus alternatus) og overføres til friske furutrær. Hos friske verter migrerer nematoder raskt gjennom plantevev og lever av parenkymatøse celler, noe som fører til en rekke overfølsomhetsreaksjoner, furuvisning og død innen et år etter infeksjon1,7,8.
Biologisk bekjempelse av furunematoder har lenge vært en utfordring, med karantenetiltak som går tilbake til det 20. århundre. Nåværende strategier for å bekjempe furunematoder involverer primært kjemiske behandlinger, inkludert trebehandling og implantasjon av nematodmidler i trestammer. De mest brukte nematodmidlene er avermektin og avermektinbenzoat, som tilhører avermektinfamilien. Disse dyre kjemikaliene er svært effektive mot mange nematodearter og anses som miljøvennlige9. Imidlertid forventes gjentatt bruk av disse nematodmidlene å skape et seleksjonspress som nesten helt sikkert vil føre til fremveksten av resistente furunematoder, slik det har blitt vist for flere insektskadegjørere, som Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella og nematodene Trichostrongylus colubriformis og Ostertagia circumcincta, som gradvis har utviklet resistens mot avermektiner10,11,12. Derfor må resistensmønstre studeres regelmessig og nematodmidler screenes kontinuerlig for å finne alternative, kostnadseffektive og miljøvennlige tiltak for å kontrollere PVD. I de siste tiårene har en rekke forfattere foreslått bruk av planteekstrakter, essensielle oljer og flyktige stoffer som nematodekontrollmidler13,14,15,16.
Vi demonstrerte nylig den nematicidale aktiviteten til indol, et intercellulært og interkingdom-signalmolekyl, i Caenorhabditis elegans 17. Indol er et utbredt intracellulært signal i mikrobiell økologi, som kontrollerer en rekke funksjoner som påvirker mikrobiell fysiologi, sporedannelse, plasmidstabilitet, medikamentresistens, biofilmdannelse og virulens 18, 19. Aktiviteten til indol og dets derivater mot andre patogene nematoder er ikke studert. I denne studien undersøkte vi den nematicidale aktiviteten til 34 indoler mot furunematoder og belyste virkningsmekanismen til den mest potente 5-jodoindolen ved hjelp av mikroskopi, time-lapse-fotografering og molekylære dockingeksperimenter, og vurderte dens toksiske effekter på planter ved hjelp av en frøspiringsanalyse.
Høye konsentrasjoner (>1,0 mM) av indol har tidligere blitt rapportert å ha en nematicid effekt på nematoder17. Etter behandling av B. xylophilus (blandede livsstadier) med indol eller 33 forskjellige indolderivater ved 1 mM, ble dødeligheten av B. xylophilus målt ved å telle levende og døde nematoder i kontroll- og behandlede grupper. Fem indoler viste betydelig nematicid aktivitet; overlevelsen til den ubehandlede kontrollgruppen var 95 ± 7 % etter 24 timer. Av de 34 testede indolene forårsaket 5-jodoindol og 4-fluorindol ved 1 mM 100 % dødelighet, mens 5,6-difluorindigo, metylindol-7-karboksylat og 7-jodoindol forårsaket omtrent 50 % dødelighet (tabell 1).
Effekt av 5-jodoindol på vakuoldannelse og metabolisme hos furuvednematoder. (A) Effekt av avermektin og 5-jodoindol på voksne hannnematoder, (B) L1-stadium nematodeegg og (C) metabolisme av B. xylophilus, (i) vakuoler ble ikke observert ved 0 timer, behandling resulterte i (ii) vakuoler, (iii) akkumulering av flere vakuoler, (iv) hevelse av vakuoler, (v) fusjon av vakuoler og (vi) dannelse av kjempevakuoler. Røde piler indikerer hevelse av vakuoler, blå piler indikerer fusjon av vakuoler og svarte piler indikerer kjempevakuoler. Skala = 50 μm.
I tillegg beskrev denne studien også den sekvensielle prosessen med metanindusert død i furunematoder (figur 4C). Metanogen død er en ikke-apoptotisk type celledød assosiert med akkumulering av fremtredende cytoplasmatiske vakuoler27. De morfologiske defektene som observeres i furunematoder ser ut til å være nært knyttet til mekanismen for metanindusert død. Mikroskopisk undersøkelse på forskjellige tidspunkter viste at gigantiske vakuoler ble dannet etter 20 timers eksponering for 5-jodoindol (0,1 mM). Mikroskopiske vakuoler ble observert etter 8 timers behandling, og antallet økte etter 12 timer. Flere store vakuoler ble observert etter 14 timer. Flere sammenvokste vakuoler var tydelig synlige etter 12–16 timers behandling, noe som indikerer at vakuolfusjon er grunnlaget for den metanogene dødsmekanismen. Etter 20 timer ble det funnet flere gigantiske vakuoler i hele ormen. Disse observasjonene representerer den første rapporten om metuose i C. elegans.
Hos 5-jodoindolbehandlede ormer ble det også observert vakuolaggregering og -ruptur (fig. 5), noe som fremgår av ormebøyning og vakuolfrigjøring til miljøet. Vakuolruptur ble også observert i eggeskallmembranen, som normalt bevares intakt av L2 under klekking (tilleggsfig. S2). Disse observasjonene støtter involveringen av væskeakkumulering og osmoreguleringssvikt, samt reversibel celleskade (RCI), i prosessen med vakuoldannelse og suppurasjon (fig. 5).
Ved å anta at jod spilte en rolle i den observerte vakuoldannelsen, undersøkte vi den nematicidale aktiviteten til natriumjodid (NaI) og kaliumjodid (KI). Ved konsentrasjoner (0,1, 0,5 eller 1 mM) påvirket de imidlertid ikke verken nematodeoverlevelse eller vakuoldannelse (tilleggsfigur S5), selv om 1 mM KI hadde en svak nematicidal effekt. På den annen side induserte 7-jodindol (1 eller 2 mM), i likhet med 5-jodindol, flere vakuoler og strukturelle deformasjoner (tilleggsfigur S6). De to jodindolene viste lignende fenotypiske egenskaper i furunematoder, mens NaI og KI ikke gjorde det. Interessant nok induserte ikke indol vakuoldannelse i B. xylophilus ved de testede konsentrasjonene (data ikke vist). Resultatene bekreftet dermed at indol-jod-komplekset er ansvarlig for vakuoliseringen og metabolismen til B. xylophilus.
Blant indolene som ble testet for nematicid aktivitet, hadde 5-jodoindol den høyeste slipindeksen på -5,89 kcal/mol, etterfulgt av 7-jodoindol (-4,48 kcal/mol), 4-fluorindol (-4,33) og indol (-4,03) (figur 6). Den sterke hydrogenbindingen mellom 5-jodoindol og leucin 218 stabiliserer bindingen, mens alle andre indolderivater binder seg til serin 260 via hydrogenbindinger i sidekjeden. Blant andre modellerte jodoindoler har 2-jodoindol en bindingsverdi på -5,248 kcal/mol, som skyldes dens viktigste hydrogenbinding med leucin 218. Andre kjente bindinger inkluderer 3-jodoindol (-4,3 kcal/mol), 4-jodoindol (-4,0 kcal/mol) og 6-fluorindol (-2,6 kcal/mol) (tilleggsfigur S8). De fleste halogenerte indoler og selve indolen, med unntak av 5-jodindol og 2-jodindol, danner en binding med serin 260. Det faktum at hydrogenbinding med leucin 218 indikerer effektiv reseptor-ligandbinding, som observert for ivermektin (tilleggsfigur S7), bekrefter at 5-jodindol og 2-jodindol, i likhet med ivermektin, binder seg tett til det aktive setet til GluCL-reseptoren via leucin 218 (figur 6 og tilleggsfigur S8). Vi foreslår at denne bindingen er nødvendig for å opprettholde den åpne porestrukturen til GluCL-komplekset, og at ved å binde seg tett til det aktive setet til GluCL-reseptoren, holder 5-jodindol, 2-jodindol, avermektin og ivermektin dermed ionekanalen åpen og tillater væskeopptak.
Molekylær docking av indol og halogenert indol til GluCL. Bindingsorienteringer av (A) indol-, (B) 4-fluorindol-, (C) 7-jodoindol- og (D) 5-jodindolligander til det aktive setet til GluCL. Proteinet er representert av et bånd, og hydrogenbindingene i ryggraden er vist som gule stiplede linjer. (A′), (B′), (C′) og (D′) viser interaksjonene mellom de tilsvarende ligandene og de omkringliggende aminosyrerestene, og hydrogenbindingene i sidekjeden er indikert med rosa stiplede piler.
Eksperimenter ble utført for å evaluere den toksiske effekten av 5-jodoindol på spiring av kål- og reddikfrø. 5-jodoindol (0,05 eller 0,1 mM) eller avermektin (10 μg/ml) hadde liten eller ingen effekt på initial spiring og fremvekst av småplanter (figur 7). I tillegg ble det ikke funnet noen signifikant forskjell mellom spirehastigheten til ubehandlede kontrollfrø og frø behandlet med 5-jodoindol eller avermektin. Effekten på forlengelse av pælerøtter og antall dannede siderøtter var ubetydelig, selv om 1 mM (10 ganger den aktive konsentrasjonen) av 5-jodoindol forsinket utviklingen av siderøtter noe. Disse resultatene indikerer at 5-jodoindol er ikke-giftig for planteceller og ikke forstyrrer planteutviklingsprosesser ved de studerte konsentrasjonene.
Effekt av 5-jodoindol på frøspiring. Spiring, spiring og lateral roting av B. oleracea- og R. raphanistrum-frø på Murashige- og Skoog-agarmedium med eller uten avermektin eller 5-jodoindol. Spiring ble registrert etter 3 dagers inkubasjon ved 22 °C.
Denne studien rapporterer flere tilfeller av nematodedrep av indoler. Det er viktig å merke seg at dette er den første rapporten om jodoindol som induserer metylering (en prosess forårsaket av akkumulering av små vakuoler som gradvis smelter sammen til gigantiske vakuoler, noe som til slutt fører til membranruptur og død) i furunåler, der jodoindol viser betydelige nematicide egenskaper som ligner på de til det kommersielle nematicidet avermektin.
Det er tidligere rapportert at indoler utøver flere signalfunksjoner i prokaryoter og eukaryoter, inkludert biofilmhemming/-dannelse, bakteriell overlevelse og patogenitet19,32,33,34. Nylig har de potensielle terapeutiske effektene av halogenerte indoler, indolalkaloider og semisyntetiske indolderivater vakt omfattende forskningsinteresse35,36,37. For eksempel har halogenerte indoler vist seg å drepe persistente Escherichia coli- og Staphylococcus aureus-celler37. I tillegg er det av vitenskapelig interesse å studere effekten av halogenerte indoler mot andre arter, slekter og riker, og denne studien er et skritt mot å nå dette målet.
Her foreslår vi en mekanisme for 5-jodoindol-indusert dødelighet i C. elegans basert på reversibel celleskade (RCI) og metylering (figur 4C og 5). Ødematøse forandringer som poser og vakuolær degenerasjon er indikatorer på RCI og metylering, manifestert som gigantiske vakuoler i cytoplasmaet48,49. RCI forstyrrer energiproduksjonen ved å redusere ATP-produksjonen, forårsake svikt i ATPase-pumpen, eller forstyrre cellemembraner og forårsake en rask tilstrømning av Na+, Ca2+ og vann50,51,52. Intracytoplasmatiske vakuoler oppstår i dyreceller som et resultat av væskeansamling i cytoplasmaet på grunn av tilstrømningen av Ca2+ og vann53. Interessant nok er denne mekanismen for celleskade reversibel hvis skaden er midlertidig og cellene begynner å produsere ATP i en viss periode, men hvis skaden vedvarer eller forverres, dør cellene.54 Våre observasjoner viser at nematoder behandlet med 5-jodoindol ikke klarer å gjenopprette normal biosyntese etter eksponering for stressforhold.
Metyleringsfenotypen indusert av 5-jodindol i B. xylophilus kan skyldes tilstedeværelsen av jod og dets molekylære fordeling, siden 7-jodindol hadde mindre hemmende effekt på B. xylophilus enn 5-jodindol (tabell 1 og tilleggsfigur S6). Disse resultatene er delvis konsistente med studiene til Maltese et al. (2014), som rapporterte at translokasjon av pyridylnitrogendelen i indol fra para- til meta-posisjonen opphevet vakuolisering, veksthemming og cytotoksisitet i U251-celler, noe som tyder på at molekylets interaksjon med et spesifikt aktivt sted i proteinet er kritisk27,44,45. Interaksjonene mellom indol eller halogenerte indoler og GluCL-reseptorer observert i denne studien støtter også denne antagelsen, ettersom 5- og 2-jodindol ble funnet å binde seg sterkere til GluCL-reseptorer enn de andre indolene som ble undersøkt (figur 6 og tilleggsfigur S8). Jodet i den andre eller femte posisjonen til indolen ble funnet å binde seg til leucin 218 på GluCL-reseptoren via hydrogenbindinger i ryggradskjeden, mens andre halogenerte indoler og indol i seg selv danner svake sidekjedehydrogenbindinger med serin 260 (figur 6). Vi spekulerer derfor i at lokaliseringen av halogenet spiller en viktig rolle i induksjonen av vakuolær degenerasjon, mens den tette bindingen av 5-jodindol holder ionekanalen åpen, og dermed tillater rask væskeinnstrømning og vakuolruptur. Den detaljerte virkningsmekanismen til 5-jodindol gjenstår imidlertid å bestemme.
Før praktisk anvendelse av 5-jodoindol, bør dens toksiske effekt på planter analyseres. Våre frøspiringseksperimenter viste at 5-jodoindol ikke hadde noen negativ effekt på frøspiring eller påfølgende utviklingsprosesser ved de studerte konsentrasjonene (figur 7). Denne studien gir dermed et grunnlag for bruk av 5-jodoindol i det økologiske miljøet for å kontrollere skadeligheten av furunematoder på furutrær.
Tidligere rapporter har vist at indolbasert terapi representerer en potensiell tilnærming for å løse problemet med antibiotikaresistens og kreftprogresjon55. I tillegg har indoler antibakterielle, krefthemmende, antioksidant-, antiinflammatoriske, antidiabetiske, antivirale, antiproliferative og antituberkuloseaktiviteter, og kan tjene som et lovende grunnlag for legemiddelutvikling56,57. Denne studien antyder for første gang potensiell bruk av jod som et antiparasittisk og ormemiddel.
Avermektin ble oppdaget for tre tiår siden og vant Nobelprisen i 2015, og bruken som et ormemiddel pågår fortsatt aktivt. På grunn av den raske utviklingen av resistens mot avermektiner hos nematoder og insektskadedyr, er det imidlertid behov for en alternativ, rimelig og miljøvennlig strategi for å kontrollere fyrrevedde-kvoten-infeksjon i furutrær. Denne studien rapporterer også mekanismen som 5-jodindol dreper furunematoder med, og at 5-jodindol har lav toksisitet for planteceller, noe som åpner for gode muligheter for fremtidig kommersiell anvendelse.
Alle eksperimentene ble godkjent av etikkomiteen ved Yeungnam University i Gyeongsan, Korea, og metodene ble utført i samsvar med retningslinjene fra etikkomiteen ved Yeungnam University.
Egg-inkubasjonseksperimenter ble utført ved hjelp av etablerte prosedyrer43. For å vurdere klekkingsrater (HR) ble 1 dag gamle voksne nematoder (omtrent 100 hunner og 100 hanner) overført til petriskåler som inneholdt soppen og fikk vokse i 24 timer. Eggene ble deretter isolert og behandlet med 5-jodoindol (0,05 mM og 0,1 mM) eller avermektin (10 μg/ml) som en suspensjon i sterilt destillert vann. Disse suspensjonene (500 μl; omtrent 100 egg) ble overført til brønnene i en 24-brønns vevskulturplate og inkubert ved 22 °C. L2-tellinger ble gjort etter 24 timers inkubasjon, men ble ansett som døde hvis cellene ikke beveget seg når de ble stimulert med en fin platinatråd. Dette eksperimentet ble utført i to trinn, hver med seks repetisjoner. Dataene fra begge eksperimentene ble kombinert og presentert. Prosentandelen av HR beregnes som følger:
Larvedødelighet ble vurdert ved hjelp av tidligere utviklede prosedyrer. Nematodeegg ble samlet inn, og embryoene ble synkronisert ved klekking i sterilt destillert vann for å generere larver i L2-stadiet. Synkroniserte larver (omtrent 500 nematoder) ble behandlet med 5-jodoindol (0,05 mM og 0,1 mM) eller avermektin (10 μg/ml) og oppdrettet på B. cinerea Petri-plater. Etter 48 timers inkubasjon ved 22 °C ble nematoder samlet inn i sterilt destillert vann og undersøkt for tilstedeværelse av L2-, L3- og L4-stadiene. Tilstedeværelsen av L3- og L4-stadiene indikerte larvetransformasjon, mens tilstedeværelsen av L2-stadiet indikerte ingen transformasjon. Bilder ble tatt ved hjelp av iRiS™ Digital Cell Imaging System. Dette eksperimentet ble utført i to stadier, hver med seks repetisjoner. Dataene fra begge eksperimentene ble kombinert og presentert.
Toksisiteten til 5-jodoindol og avermektin for frø ble vurdert ved hjelp av spiretester på Murashige- og Skoog-agarplater.62 Frø av B. oleracea og R. raphanistrum ble først bløtlagt i sterilt destillert vann i én dag, vasket med 1 ml 100 % etanol, sterilisert med 1 ml 50 % kommersielt blekemiddel (3 % natriumhypokloritt) i 15 minutter og vasket fem ganger med 1 ml sterilt vann. De steriliserte frøene ble deretter presset på spireagarplater som inneholdt 0,86 g/l (0,2X) Murashige- og Skoog-medium og 0,7 % bakteriologisk agar med eller uten 5-jodoindol eller avermektin. Platene ble deretter inkubert ved 22 °C, og bilder ble tatt etter 3 dagers inkubasjon. Dette eksperimentet ble utført i to trinn, som hver hadde seks repetisjoner.
Publisert: 26. feb. 2025