Furu-nematoden er en karantene migrerende endoparasitt kjent for å forårsake alvorlige økonomiske tap i furuskogens økosystemer. Denne studien gjennomgår den nematicide aktiviteten til halogenerte indoler mot furumematoder og deres virkningsmekanisme. De nematicide aktivitetene til 5-jodindol og avermektin (positiv kontroll) mot furumematoder var lik og høy ved lave konsentrasjoner (10 μg/mL). 5-jodindol redusert fruktbarhet, reproduksjonsaktivitet, embryonal og larvedødelighet og bevegelsesadferd. Molekylære interaksjoner av ligander med virvelløse dyr-spesifikke glutamat-gatede kloridkanalreseptorer støtter oppfatningen om at 5-jodoindol, som avermectin, binder seg tett til det reseptoraktive stedet. 5-jodoindol induserte også ulike fenotypiske deformasjoner i nematoder, inkludert unormal organkollaps/krymping og økt vakuolisering. Disse resultatene tyder på at vakuoler kan spille en rolle i nematodemetyleringsmediert død. Viktigere, 5-jodindol var ikke-giftig for begge plantearter (kål og reddik). Dermed viser denne studien at jodindolpåføring under miljøforhold kan kontrollere furuviskeskade.
Furuvednematoden (Bursaphelenchus xylophilus) tilhører furuvednematodene (PWN), migrerende endoparasittiske nematoder som er kjent for å forårsake alvorlig økologisk skade på furuskogens økosystemer1. Furuviskesykdom (PWD) forårsaket av furuvednematoden er i ferd med å bli et alvorlig problem på flere kontinenter, inkludert Asia og Europa, og i Nord-Amerika ødelegger nematoden introduserte furuarter1,2. Nedgang i furutrær er et stort økonomisk problem, og utsiktene til den globale spredningen er bekymringsfull3. Følgende furuarter er oftest angrepet av nematoden: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii og Pinus radiata4. Furu nematode er en alvorlig sykdom som kan drepe furutrær innen uker eller måneder etter infeksjon. I tillegg er utbrudd av fururematode vanlig i en rekke økosystemer, så vedvarende smittekjeder er etablert1.
Bursaphelenchus xylophilus er en planteparasittisk nematode i karantene som tilhører superfamilien Aphelenchoidea og kladde 102.5. Nematoden lever av sopp og formerer seg i trevevet til furutrær, og utvikler seg til fire forskjellige larvestadier: L1, L2, L3, L4 og et voksent individ1,6. Under forhold med matmangel går furunematoden over i et spesialisert larvestadium – dauer, som parasitterer sin vektor – furubarkbillen (Monochamus alternatus) og overføres til friske furutrær. Hos friske verter migrerer nematoder raskt gjennom plantevev og lever av parenkymatøse celler, noe som fører til en rekke overfølsomhetsreaksjoner, furuvisnning og død innen et år etter infeksjon1,7,8.
Biologisk bekjempelse av furunematoder har lenge vært en utfordring, med karantenetiltak helt tilbake til 1900-tallet. Nåværende strategier for bekjempelse av furumematoder involverer først og fremst kjemiske behandlinger, inkludert fumigering av tre og implantasjon av nematicider i trestammer. De mest brukte nematicidene er avermektin og avermektinbenzoat, som tilhører avermektinfamilien. Disse dyre kjemikaliene er svært effektive mot mange nematodearter og anses som miljøsikre9. Gjentatt bruk av disse nematicidene forventes imidlertid å skape seleksjonspress som nesten helt sikkert vil føre til fremveksten av resistente furunematoder, slik det er påvist for flere skadeinsekter, som Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella og nematodene Trichostrongylus colubriformis og Ostertagia circus, som har utviklet resistens mot graducinacta circa. avermektiner 10,11,12. Derfor må resistensmønstre regelmessig studeres og nematicider screenes kontinuerlig for å finne alternative, kostnadseffektive og miljøvennlige tiltak for å kontrollere PVD. De siste tiårene har en rekke forfattere foreslått bruk av planteekstrakter, essensielle oljer og flyktige stoffer som nematodekontrollmidler13,14,15,16.
Vi har nylig demonstrert den nematicide aktiviteten til indol, et intercellulært og interkingdom-signalmolekyl, i Caenorhabditis elegans 17 . Indol er et utbredt intracellulært signal i mikrobiell økologi, og kontrollerer en rekke funksjoner som påvirker mikrobiell fysiologi, sporedannelse, plasmidstabilitet, medikamentresistens, biofilmdannelse og virulens 18, 19 . Aktiviteten til indol og dets derivater mot andre patogene nematoder er ikke studert. I denne studien undersøkte vi den nematicide aktiviteten til 34 indoler mot furumematoder og belyste virkningsmekanismen til den mest potente 5-jodoindolen ved hjelp av mikroskopi, time-lapse fotografering og molekylære docking-eksperimenter, og vurderte dens toksiske effekter på planter ved hjelp av en frøspiringsanalyse.
Høye konsentrasjoner (>1,0 mM) av indol har tidligere blitt rapportert å ha en nematicide effekt på nematoder17. Etter behandling av B. xylophilus (blandede livsstadier) med indol eller 33 forskjellige indolderivater ved 1 mM, ble dødeligheten av B. xylophilus målt ved å telle levende og døde nematoder i kontroll- og behandlede grupper. Fem indoler viste signifikant nematicid aktivitet; overlevelsen til den ubehandlede kontrollgruppen var 95 ± 7 % etter 24 timer. Av de 34 indolene som ble testet, forårsaket 5-jodindol og 4-fluorindol ved 1 mM 100 % dødelighet, mens 5,6-difluorindigo, metylindol-7-karboksylat og 7-jodindol forårsaket omtrent 50 % dødelighet (tabell 1).
Effekt av 5-jodindol på vakuoldannelse og metabolisme av furuvednematoder. (A) Effekt av avermectin og 5-jodoindol på voksne mannlige nematoder, (B) L1 stadium nematode egg og (C) metabolisme av B. xylophilus, (i) vakuoler ble ikke observert etter 0 timer, behandling resulterte i (ii) vakuoler, (iii) akkumulering av flere vakuoler, (iv) fusjon av vacuoler, (iv) fusjon av vacuoles vakuoler og (vi) dannelse av gigantiske vakuoler. Røde piler indikerer hevelse av vakuoler, blå piler indikerer fusjon av vakuoler og svarte piler indikerer gigantiske vakuoler. Målestokk = 50 μm.
I tillegg beskrev denne studien også den sekvensielle prosessen med metan-indusert død i furumematoder (Figur 4C). Metanogen død er en ikke-apoptotisk type celledød assosiert med akkumulering av fremtredende cytoplasmatiske vakuoler27. De morfologiske defektene som er observert i furumematoder ser ut til å være nært knyttet til mekanismen for metan-indusert død. Mikroskopisk undersøkelse til forskjellige tidspunkter viste at gigantiske vakuoler ble dannet etter 20 timers eksponering for 5-jodindol (0,1 mM). Mikroskopiske vakuoler ble observert etter 8 timers behandling, og antallet økte etter 12 timer. Flere store vakuoler ble observert etter 14 timer. Flere sammensmeltede vakuoler var tydelig synlige etter 12–16 timers behandling, noe som indikerer at vakuolfusjon er grunnlaget for den metanogene dødsmekanismen. Etter 20 timer ble det funnet flere gigantiske vakuoler i hele ormen. Disse observasjonene representerer den første rapporten om metuose hos C. elegans.
Hos 5-jodindolbehandlede ormer ble det også observert vakuoleaggregering og -ruptur (fig. 5), noe som fremgår av ormbøyning og vakuolefrigjøring til miljøet. Vakuoleforstyrrelser ble også observert i eggeskallmembranen, som normalt er bevart intakt av L2 under klekking (Supplerende Fig. S2). Disse observasjonene støtter involvering av væskeakkumulering og osmoregulatorisk svikt, samt reversibel celleskade (RCI), i prosessen med vakuoldannelse og suppurasjon (fig. 5).
Med en hypotese om jods rolle i den observerte vakuoldannelsen, undersøkte vi den nematicide aktiviteten til natriumjodid (NaI) og kaliumjodid (KI). Ved konsentrasjoner (0,1, 0,5 eller 1 mM) påvirket de imidlertid verken nematodeoverlevelse eller vakuoledannelse (Supplerende Fig. S5), selv om 1 mM KI hadde en svak nematicidal effekt. På den annen side induserte 7-jodindol (1 eller 2 mM), som 5-jodindol, flere vakuoler og strukturelle deformasjoner (Supplerende Fig. S6). De to jodindolene viste lignende fenotypiske egenskaper i furumematoder, mens NaI og KI ikke gjorde det. Interessant nok induserte ikke indol vakuoldannelse i B. xylophilus ved de testede konsentrasjonene (data ikke vist). Resultatene bekreftet således at indol-jod-komplekset er ansvarlig for vakuolisering og metabolisme av B. xylophilus.
Blant indolene som ble testet for nematicid aktivitet, hadde 5-jodindol den høyeste glideindeksen på -5,89 kcal/mol, etterfulgt av 7-jodindol (-4,48 kcal/mol), 4-fluorindol (-4,33) og indol (-4,03) (figur 6). Den sterke ryggradshydrogenbindingen av 5-jodindol til leucin 218 stabiliserer bindingen, mens alle andre indolderivater binder seg til serin 260 via sidekjedehydrogenbindinger. Blant andre modellerte jodindoler har 2-jodindol en bindingsverdi på -5,248 kcal/mol, noe som skyldes dens hovedhydrogenbinding med leucin 218. Andre kjente bindinger inkluderer 3-jodindol (-4,3 kcal/mol), 4-jodindol (-4,0 kcal/mol) og 6-2 fluorindol (s-2-fluorindol) Figur S8). De fleste halogenerte indoler og indol i seg selv, med unntak av 5-jodoindol og 2-jodoindol, danner en binding med serin 260. Det faktum at hydrogenbinding med leucin 218 er en indikasjon på effektiv reseptor-ligandbinding, som observert for ivermektin (tilleggsfig. S7-iodoindol liknende 5-iodoindol og iodoindol, 5 ivermectin, binder seg tett til det aktive stedet til GluCL-reseptoren via leucin 218 (fig. 6 og tilleggsfig. S8). Vi foreslår at denne bindingen er nødvendig for å opprettholde den åpne porestrukturen til GluCL-komplekset, og at ved tett binding til det aktive stedet til GluCL-reseptoren, 5-jodoindol, 2-jodoindol, avermectin og ivermectin, dermed holde ionekanalen åpen og tillate væskeopptak.
Molekylær dokking av indol og halogenert indol til GluCL. Bindingsorienteringer av (A) indol, (B) 4-fluorindol, (C) 7-jodoindol, og (D) 5-jodoindol ligander til det aktive stedet av GluCL. Proteinet er representert av et bånd, og ryggradens hydrogenbindinger er vist som gule stiplede linjer. (A′), (B′), (C′) og (D′) viser interaksjonene mellom de tilsvarende liganden med de omkringliggende aminosyrerestene, og sidekjedehydrogenbindingene er indikert med rosa stiplede piler.
Eksperimenter ble utført for å evaluere den toksiske effekten av 5-jodindol på spiring av kål- og reddikfrø. 5-jodindol (0,05 eller 0,1 mM) eller avermektin (10 μg/ml) hadde liten eller ingen effekt på initial spiring og fremvekst av småplanter (Figur 7). I tillegg ble det ikke funnet noen signifikant forskjell mellom spirehastigheten til ubehandlede kontroller og frø behandlet med 5-jodindol eller avermektin. Effekten på forlengelse av pælerot og antall dannede siderøtter var ubetydelig, selv om 1 mM (10 ganger dens aktive konsentrasjon) av 5-jodindol forsinket utviklingen av siderøtter litt. Disse resultatene indikerer at 5-jodoindol er ikke-toksisk for planteceller og ikke forstyrrer planteutviklingsprosesser ved konsentrasjonene som er studert.
Effekt av 5-jodindol på frøspiring. Spiring, spiring og lateral roting av B. oleracea og R. raphanistrum frø på Murashige og Skoog agar medium med eller uten avermectin eller 5-jodoindol. Spiring ble registrert etter 3 dagers inkubering ved 22°C.
Denne studien rapporterer flere tilfeller av nematodedrepning av indoler. Viktigere er at dette er den første rapporten om jodoindol-induserende metylering (en prosess forårsaket av akkumulering av små vakuoler som gradvis smelter sammen til gigantiske vakuoler, som til slutt fører til membranbrudd og død) i furunåler, med jodoindol som viser betydelige nematicide egenskaper som ligner de til det kommersielle nematinidet avermekt.
Indoler har tidligere blitt rapportert å utøve flere signalfunksjoner i prokaryoter og eukaryoter, inkludert biofilmhemming/dannelse, bakteriell overlevelse og patogenisitet19,32,33,34. Nylig har de potensielle terapeutiske effektene av halogenerte indoler, indolalkaloider og semisyntetiske indolderivater tiltrukket seg omfattende forskningsinteresse35,36,37. For eksempel har halogenerte indoler vist seg å drepe vedvarende Escherichia coli- og Staphylococcus aureus-celler37. I tillegg er det av vitenskapelig interesse å studere effekten av halogenerte indoler mot andre arter, slekter og riker, og denne studien er et skritt mot å nå dette målet.
Her foreslår vi en mekanisme for 5-jodoindol-indusert dødelighet i C. elegans basert på reversibel celleskade (RCI) og metylering (figur 4C og 5). Ødematøse endringer som hevelser og vakuolar degenerasjon er indikatorer på RCI og metylering, manifestert som gigantiske vakuoler i cytoplasma48,49. RCI forstyrrer energiproduksjonen ved å redusere ATP-produksjonen, forårsake svikt i ATPase-pumpen, eller forstyrre cellemembraner og forårsake en rask tilstrømning av Na+, Ca2+ og vann50,51,52. Intracytoplasmatiske vakuoler oppstår i dyreceller som følge av væskeansamling i cytoplasma på grunn av tilstrømning av Ca2+ og vann53. Interessant nok er denne mekanismen for celleskade reversibel hvis skaden er midlertidig og cellene begynner å produsere ATP i en viss periode, men hvis skaden vedvarer eller forverres, dør cellene.54 Våre observasjoner viser at nematoder behandlet med 5-jodoindol ikke klarer å gjenopprette normal biosyntese etter eksponering for stresstilstander.
Metyleringsfenotypen indusert av 5-jodindol i B. xylophilus kan skyldes tilstedeværelsen av jod og dets molekylære fordeling, siden 7-jodindol hadde mindre hemmende effekt på B. xylophilus enn 5-jodindol (tabell 1 og tilleggsfigur S6). Disse resultatene er delvis i samsvar med studiene til Maltese et al. (2014), som rapporterte at translokasjon av pyridylnitrogendelen i indol fra para- til metaposisjonen opphevet vakuolisering, vekstinhibering og cytotoksisitet i U251-celler, noe som tyder på at interaksjonen av molekylet med et spesifikt aktivt sted i proteinet er kritisk27,44,45. Interaksjonene mellom indol eller halogenerte indoler og GluCL-reseptorer observert i denne studien støtter også denne forestillingen, ettersom 5- og 2-jodoindol ble funnet å binde seg sterkere til GluCL-reseptorer enn de andre indolene som ble undersøkt (figur 6 og tilleggsfigur S8). Jodet i den andre eller femte posisjonen til indolen ble funnet å binde seg til leucin 218 av GluCL-reseptoren via ryggradshydrogenbindinger, mens andre halogenerte indoler og indol selv danner svake sidekjedehydrogenbindinger med serin 260 (figur 6). Vi spekulerer derfor i at lokaliseringen av halogenet spiller en viktig rolle i induksjonen av vakuolar degenerasjon, mens den tette bindingen av 5-jodoindol holder ionekanalen åpen, og tillater dermed rask væskeinnstrømning og vakuolbrudd. Den detaljerte virkningsmekanismen til 5-jodindol gjenstår imidlertid å bestemme.
Før praktisk bruk av 5-jodindol, bør dets toksiske effekt på planter analyseres. Våre frøspiringseksperimenter viste at 5-jodindol ikke hadde noen negativ effekt på frøspiring eller påfølgende utviklingsprosesser ved konsentrasjonene som ble studert (Figur 7). Dermed gir denne studien grunnlag for bruk av 5-jodindol i det økologiske miljøet for å kontrollere furunematodes skadelighet for furutrær.
Tidligere rapporter har vist at indolbasert terapi representerer en potensiell tilnærming for å løse problemet med antibiotikaresistens og kreftprogresjon55. I tillegg har indoler antibakterielle, antikreft-, antioksidant-, anti-inflammatoriske, antidiabetiske, antivirale, antiproliferative og antituberkulose-aktiviteter og kan tjene som et lovende grunnlag for utvikling av medikamenter56,57. Denne studien antyder for første gang potensiell bruk av jod som et antiparasittisk og anthelmintisk middel.
Avermectin ble oppdaget for tre tiår siden og vant Nobelprisen i 2015, og bruken av det som anthelmintikum pågår fortsatt aktivt. Men på grunn av den raske utviklingen av resistens mot avermektiner i nematoder og skadeinsekter, er det nødvendig med en alternativ, rimelig og miljøvennlig strategi for å kontrollere PWN-infeksjon i furutrær. Denne studien rapporterer også mekanismen som 5-jodindol dreper furunematoder og at 5-jodindol har lav toksisitet for planteceller, noe som åpner for gode muligheter for fremtidig kommersiell anvendelse.
Alle eksperimenter ble godkjent av Etikkkomiteen ved Yeungnam University, Gyeongsan, Korea, og metodene ble utført i samsvar med retningslinjene fra Etikkkomiteen ved Yeungnam University.
Egginkubasjonseksperimenter ble utført ved bruk av etablerte prosedyrer43. For å vurdere klekkingshastigheter (HR), ble 1 dag gamle voksne nematoder (omtrent 100 hunner og 100 hanner) overført til petriskåler som inneholdt soppen og fikk vokse i 24 timer. Egg ble deretter isolert og behandlet med 5-jodindol (0,05 mM og 0,1 mM) eller avermectin (10 μg/ml) som en suspensjon i sterilt destillert vann. Disse suspensjonene (500 μl; ca. 100 egg) ble overført til brønnene på en 24-brønners vevskulturplate og inkubert ved 22 °C. L2-tellinger ble gjort etter 24 timers inkubasjon, men ble ansett som døde hvis cellene ikke beveget seg når de ble stimulert med en fin platinatråd. Dette eksperimentet ble utført i to trinn, hver med seks repetisjoner. Dataene fra begge eksperimentene ble kombinert og presentert. Prosentandelen av HR beregnes som følger:
Larvedødelighet ble vurdert ved hjelp av tidligere utviklede prosedyrer. Nematodeegg ble samlet og embryoer ble synkronisert ved klekking i sterilt destillert vann for å generere L2-stadiumlarver. Synkroniserte larver (ca. 500 nematoder) ble behandlet med 5-jodindol (0,05 mM og 0,1 mM) eller avermectin (10 μg/ml) og oppdrettet på B. cinerea Petri-plater. Etter 48 timers inkubering ved 22 °C ble nematoder samlet i sterilt destillert vann og undersøkt for tilstedeværelse av L2-, L3- og L4-stadier. Tilstedeværelsen av L3- og L4-stadier indikerte larvetransformasjon, mens tilstedeværelsen av L2-stadiet indikerte ingen transformasjon. Bilder ble tatt med iRiS™ Digital Cell Imaging System. Dette eksperimentet ble utført i to trinn, hver med seks repetisjoner. Dataene fra begge eksperimentene ble kombinert og presentert.
Toksisiteten til 5-jodindol og avermektin for frø ble vurdert ved bruk av spiretester på Murashige og Skoog agarplater.62 Frøene fra B. oleracea og R. raphanistrum ble først bløtlagt i sterilt destillert vann i én dag, vasket med 1 ml 100 % etanol, sterilisert med kommersielt etanol, 50 % 1 ml blekemiddel (kloritt 50 % 1 ml). 15 min, og vasket fem ganger med 1 ml sterilt vann. De steriliserte frøene ble deretter presset på spireagarplater inneholdende 0,86 g/l (0,2X) Murashige og Skoog medium og 0,7% bakteriologisk agar med eller uten 5-jodindol eller avermektin. Platene ble deretter inkubert ved 22 °C, og bilder ble tatt etter 3 dagers inkubasjon. Dette eksperimentet ble utført i to trinn, som hver hadde seks repetisjoner.
Innleggstid: 26. februar 2025