Denne studien vurderte dødelighet, subletalitet og toksisitet av kommersiellecypermetrinformuleringer til anuranske rumpetroll. I den akutte testen ble konsentrasjoner på 100–800 μg/L testet i 96 timer. I den kroniske testen ble naturlig forekommende cypermetrinkonsentrasjoner (1, 3, 6 og 20 μg/L) testet for dødelighet, etterfulgt av mikronukleustesting og kjerneavvik i røde blodlegemer i 7 dager. LC50 for den kommersielle cypermetrinformuleringen til rumpetroll var 273,41 μg L−1. I den kroniske testen resulterte den høyeste konsentrasjonen (20 μg L−1) i mer enn 50 % dødelighet, da den drepte halvparten av rumpetrollene som ble testet. Mikronukleustesten viste signifikante resultater ved 6 og 20 μg L−1, og flere kjerneavvik ble oppdaget, noe som indikerer at den kommersielle cypermetrinformuleringen har genotoksisk potensial mot P. gracilis. Cypermetrin er en høy risiko for denne arten, noe som indikerer at den kan forårsake flere problemer og påvirke dynamikken i dette økosystemet på kort og lang sikt. Derfor kan det konkluderes med at kommersielle cypermetrinformuleringer har toksiske effekter på P. gracilis.
På grunn av den kontinuerlige utvidelsen av landbruksaktiviteter og intensiv bruk avskadedyrbekjempelseTiltakene innebærer at vannlevende dyr ofte blir utsatt for plantevernmidler1,2. Forurensning av vannressurser nær jordbruksmarker kan påvirke utviklingen og overlevelsen til ikke-målorganismer som amfibier.
Amfibier blir stadig viktigere i vurderingen av miljømatriser. Anuraner regnes som gode bioindikatorer for miljøforurensninger på grunn av deres unike egenskaper som komplekse livssykluser, rask larvevekst, trofisk status, permeabel hud10,11, avhengighet av vann for reproduksjon12 og ubeskyttede egg11,13,14. Den lille vannfrosken (Physalaemus gracilis), ofte kjent som gråtende frosk, har vist seg å være en bioindikatorart for plantevernmiddelforurensning4,5,6,7,15. Arten finnes i stillestående vann, beskyttede områder eller områder med variabel habitat i Argentina, Uruguay, Paraguay og Brasil1617 og regnes som stabil av IUCN-klassifiseringen på grunn av sin brede utbredelse og toleranse for forskjellige habitater18.
Subletale effekter er rapportert hos amfibier etter eksponering for cypermetrin, inkludert atferdsmessige, morfologiske og biokjemiske endringer hos rumpetroll23,24,25, endret dødelighet og metamorfosetid, enzymatiske endringer, redusert klekkesuksess24,25, hyperaktivitet26, hemming av kolinesteraseaktivitet27 og endringer i svømmeprestasjoner7,28. Studier av de gentoksiske effektene av cypermetrin hos amfibier er imidlertid begrensede. Derfor er det viktig å vurdere anuranarters følsomhet for cypermetrin.
Miljøforurensning påvirker normal vekst og utvikling hos amfibier, men den mest alvorlige bivirkningen er genetisk skade på DNA forårsaket av eksponering for plantevernmidler13. Analyse av blodcellers morfologi er en viktig bioindikator på forurensning og potensiell toksisitet av et stoff for ville arter29. Mikronukleustesten er en av de mest brukte metodene for å bestemme gentoksisiteten til kjemikalier i miljøet30. Det er en rask, effektiv og rimelig metode som er en god indikator på kjemisk forurensning av organismer som amfibier31,32 og kan gi informasjon om eksponering for genotoksiske forurensninger33.
Målet med denne studien var å evaluere det toksiske potensialet til kommersielle cypermetrinformuleringer for små akvatiske rumpetroll ved hjelp av en mikronukleustest og økologisk risikovurdering.
Kumulativ dødelighet (%) av P. gracilis-rummetroller eksponert for forskjellige konsentrasjoner av kommersielt cypermetrin i løpet av den akutte perioden av testen.
Kumulativ dødelighet (%) av P. gracilis-rummetroll eksponert for forskjellige konsentrasjoner av kommersielt cypermetrin under en kronisk test.
Den observerte høye dødeligheten var et resultat av gentoksiske effekter hos amfibier eksponert for forskjellige konsentrasjoner av cypermetrin (6 og 20 μg/L), noe som fremgår av tilstedeværelsen av mikrokjerner (MN) og kjerneavvik i erytrocytter. Dannelse av MN indikerer feil i mitose og er assosiert med dårlig binding av kromosomer til mikrotubuli, defekter i proteinkomplekser som er ansvarlige for kromosomopptak og -transport, feil i kromosomsegregering og feil i reparasjon av DNA-skader38,39 og kan være relatert til plantevernmiddelindusert oksidativt stress40,41. Andre avvik ble observert ved alle evaluerte konsentrasjoner. Økende cypermetrinkonsentrasjoner økte kjerneavvik i erytrocytter med henholdsvis 5 % og 20 % ved de laveste (1 μg/L) og høyeste (20 μg/L) dosene. For eksempel kan endringer i DNA-et til en art ha alvorlige konsekvenser for både kortsiktig og langsiktig overlevelse, noe som resulterer i populasjonsnedgang, endret reproduksjonsevne, innavl, tap av genetisk mangfold og endrede migrasjonsrater. Alle disse faktorene kan påvirke artens overlevelse og vedlikehold42,43. Dannelsen av erytroide abnormaliteter kan indikere en blokkering i cytokinesen, noe som resulterer i unormal celledeling (binukleære erytrocytter)44,45; flerlobede kjerner er fremspring i kjernemembranen med flere lapper46, mens andre erytroide abnormaliteter kan være assosiert med DNA-amplifisering, slik som kjernenyrer/blemmer47. Tilstedeværelsen av anukleære erytrocytter kan indikere nedsatt oksygentransport, spesielt i forurenset vann48,49. Apoptose indikerer celledød50.
Andre studier har også vist de gentoksiske effektene av cypermetrin. Kabaña et al.51 demonstrerte tilstedeværelsen av mikrokjerner og kjerneforandringer som binukleære celler og apoptotiske celler i Odontophrynus americanus-celler etter eksponering for høye konsentrasjoner av cypermetrin (5000 og 10 000 μg L−1) i 96 timer. Cypermetrinindusert apoptose ble også påvist i P. biligonigerus52 og Rhinella arenarum53. Disse resultatene tyder på at cypermetrin har gentoksiske effekter på en rekke vannlevende organismer, og at MN- og ENA-analysen kan være en indikator på subletale effekter på amfibier og kan være anvendelig for stedegne arter og ville populasjoner utsatt for giftstoffer12.
Kommersielle formuleringer av cypermetrin utgjør en høy miljøfare (både akutt og kronisk), med HQ-verdier som overstiger det amerikanske miljøvernbyråets (EPA) nivå54, noe som kan påvirke arten negativt hvis den er tilstede i miljøet. I den kroniske risikovurderingen var NOEC for dødelighet 3 μg L−1, noe som bekrefter at konsentrasjonene funnet i vann kan utgjøre en risiko for arten55. Den dødelige NOEC for R. arenarum-larver eksponert for en blanding av endosulfan og cypermetrin var 500 μg L−1 etter 168 timer; denne verdien sank til 0,0005 μg L−1 etter 336 timer. Forfatterne viser at jo lengre eksponeringen er, desto lavere er konsentrasjonene som er skadelige for arten. Det er også viktig å fremheve at NOEC-verdiene var høyere enn for P. gracilis ved samme eksponeringstid, noe som indikerer at artens respons på cypermetrin er artsspesifikk. Videre, når det gjelder dødelighet, nådde CHQ-verdien for P. gracilis etter eksponering for cypermetrin 64,67, som er høyere enn referanseverdien satt av US Environmental Protection Agency54, og CHQ-verdien for R. arenarum-larver var også høyere enn denne verdien (CHQ > 388,00 etter 336 timer), noe som indikerer at de studerte insektmidlene utgjør en høy risiko for flere amfibiearter. Tatt i betraktning at P. gracilis trenger omtrent 30 dager for å fullføre metamorfose56, kan det konkluderes med at de studerte konsentrasjonene av cypermetrin kan bidra til populasjonsnedgang ved å forhindre at infiserte individer går inn i voksen- eller reproduksjonsstadiet i tidlig alder.
I den beregnede risikovurderingen av mikrokjerner og andre erytrocyttkjerneavvik varierte CHQ-verdiene fra 14,92 til 97,00, noe som indikerer at cypermetrin hadde en potensiell gentoksisk risiko for P. gracilis selv i dens naturlige habitat. Med tanke på dødeligheten var den maksimale konsentrasjonen av xenobiotiske forbindelser som kunne tolereres for P. gracilis 4,24 μg L−1. Imidlertid viste konsentrasjoner så lave som 1 μg/L også gentoksiske effekter. Dette kan føre til en økning i antall unormale individer57 og påvirke utviklingen og reproduksjonen av arter i deres habitater, noe som kan føre til en nedgang i amfibiepopulasjoner.
Kommersielle formuleringer av insektmidlet cypermetrin viste høy akutt og kronisk toksisitet for P. gracilis. Høyere dødelighetsrater ble observert, sannsynligvis på grunn av toksiske effekter, noe som fremgår av tilstedeværelsen av mikrokjerner og erytrocyttkjerneavvik, spesielt taggete kjerner, flikete kjerner og vesikulære kjerner. I tillegg viste de studerte artene økt miljørisiko, både akutt og kronisk. Disse dataene, kombinert med tidligere studier av vår forskningsgruppe, viste at selv forskjellige kommersielle formuleringer av cypermetrin fortsatt forårsaket redusert acetylkolinesterase (AChE) og butyrylkolinesterase (BChE) aktivitet og oksidativt stress58, og resulterte i endringer i svømmeaktivitet og orale misdannelser59 hos P. gracilis, noe som indikerer at kommersielle formuleringer av cypermetrin har høy dødelig og subletal toksisitet for denne arten. Hartmann et al. 60 fant at kommersielle formuleringer av cypermetrin var de mest giftige for P. gracilis og en annen art av samme slekt (P. cuvieri) sammenlignet med ni andre plantevernmidler. Dette tyder på at lovlig godkjente konsentrasjoner av cypermetrin for miljøvern kan føre til høy dødelighet og langsiktig populasjonsnedgang.
Ytterligere studier er nødvendige for å vurdere plantevernmiddelets toksisitet for amfibier, ettersom konsentrasjonene som finnes i miljøet kan forårsake høy dødelighet og utgjøre en potensiell risiko for P. gracilis. Forskning på amfibiearter bør oppmuntres, ettersom data om disse organismene er knappe, spesielt om brasilianske arter.
Den kroniske toksisitetstesten varte i 168 timer (7 dager) under statiske forhold, og de subletale konsentrasjonene var: 1, 3, 6 og 20 μg ai L−1. I begge forsøkene ble 10 rumpetroll per behandlingsgruppe evaluert med seks replikat, totalt 60 rumpetroll per konsentrasjon. Vannbehandlingen fungerte samtidig som negativ kontroll. Hvert forsøksoppsett besto av en steril glassskål med en kapasitet på 500 ml og en tetthet på 1 rumpetroll per 50 ml løsning. Kolben ble dekket med polyetylenfilm for å forhindre fordampning og ble kontinuerlig luftet.
Vannet ble kjemisk analysert for å bestemme plantevernmiddelkonsentrasjoner ved 0, 96 og 168 timer. I følge Sabin et al. 68 og Martins et al. 69 ble analysene utført ved Pesticide Analysis Laboratory (LARP) ved Federal University of Santa Maria ved bruk av gasskromatografi koblet til trippel kvadrupol massespektrometri (Varian modell 1200, Palo Alto, California, USA). Kvantitativ bestemmelse av plantevernmidler i vann er vist som tilleggsmateriale (tabell SM1).
For mikronukleustesten (MNT) og testen for kjerneavvik i røde blodceller (RNA) ble 15 rumpetroll fra hver behandlingsgruppe analysert. Rumpetrollene ble bedøvet med 5 % lidokain (50 mg g-170), og blodprøvene ble samlet inn ved hjertepunksjon med hepariniserte engangssprøyter. Bloduttrykk ble fremstilt på sterile objektglass, lufttørket, fiksert med 100 % metanol (4 °C) i 2 minutter og deretter farget med 10 % Giemsa-løsning i 15 minutter i mørket. På slutten av prosessen ble objektglassene vasket med destillert vann for å fjerne overflødig fargestoff og tørket ved romtemperatur.
Minst 1000 røde blodceller fra hver rumpetroll ble analysert ved hjelp av et 100× mikroskop med et 71-objektiv for å bestemme tilstedeværelsen av MN og ENA. Totalt 75 796 røde blodceller fra rumpetroll ble evaluert med tanke på cypermetrinkonsentrasjoner og kontroller. Genotoksisitet ble analysert i henhold til metoden til Carrasco et al. og Fenech et al.38,72 ved å bestemme hyppigheten av følgende kjernelesjoner: (1) anukleære celler: celler uten kjerne; (2) apoptotiske celler: kjernefragmentering, programmert celledød; (3) binukleære celler: celler med to kjerner; (4) kjerneknopper eller blebceller: celler med kjerner med små fremspring i kjernemembranen, blemmer av samme størrelse som mikrokjerner; (5) karyolyserte celler: celler med kun omrisset av kjernen uten indre materiale; (6) hakkceller: celler med kjerner med tydelige sprekker eller hakk i formen, også kalt nyreformede kjerner; (7) lobulerte celler: celler med kjernefremspring større enn de ovennevnte vesiklene; og (8) mikroceller: celler med kondenserte kjerner og redusert cytoplasma. Endringene ble sammenlignet med de negative kontrollresultatene.
Resultatene av den akutte toksisitetstesten (LC50) ble analysert ved hjelp av GBasic-programvare og TSK-Trimmed Spearman-Karber-metoden74. Dataene fra den kroniske testen ble forhåndstestet for feilnormalitet (Shapiro-Wilks) og varianshomogenitet (Bartlett). Resultatene ble analysert ved hjelp av enveis variansanalyse (ANOVA). Tukeys test ble brukt til å sammenligne data seg imellom, og Dunnetts test ble brukt til å sammenligne data mellom behandlingsgruppen og den negative kontrollgruppen.
LOEC- og NOEC-data ble analysert ved hjelp av Dunnetts test. Statistiske tester ble utført ved hjelp av Statistica 8.0-programvaren (StatSoft) med et signifikansnivå på 95 % (p < 0,05).
Publisert: 13. mars 2025