Denne studien vurderte dødeligheten, subletaliteten og toksisiteten til kommersiellecypermetrinformuleringer til anuran rumpetroll. I den akutte testen ble konsentrasjoner på 100–800 μg/L testet i 96 timer. I den kroniske testen ble naturlig forekommende cypermetrinkonsentrasjoner (1, 3, 6 og 20 μg/L) testet for dødelighet, etterfulgt av mikronukleustesting og kjerneavvik i røde blodlegemer i 7 dager. LC50 for den kommersielle cypermetrin-formuleringen til rumpetroll var 273,41 μg L−1. I den kroniske testen resulterte den høyeste konsentrasjonen (20 μg L−1) i mer enn 50 % dødelighet, da den drepte halvparten av rumpetrollene som ble testet. Mikronukleustesten viste signifikante resultater ved 6 og 20 μg L−1 og flere nukleære abnormiteter ble oppdaget, noe som indikerer at den kommersielle cypermetrinformuleringen har genotoksisk potensial mot P. gracilis. Cypermetrin er en høy risiko for denne arten, noe som indikerer at det kan forårsake flere problemer og påvirke dynamikken i dette økosystemet på kort og lang sikt. Derfor kan det konkluderes med at kommersielle cypermetrinformuleringer har toksiske effekter på P. gracilis.
På grunn av kontinuerlig utvidelse av landbruksaktiviteter og intensiv bruk avskadedyrkontrolltiltak, blir vannlevende dyr ofte utsatt for plantevernmidler1,2. Forurensning av vannressurser nær jordbruksmark kan påvirke utviklingen og overlevelsen av ikke-målorganismer som amfibier.
Amfibier blir stadig viktigere i vurderingen av miljømatriser. Anuraner anses som gode bioindikatorer for miljøgifter på grunn av deres unike egenskaper som komplekse livssykluser, raske larveveksthastigheter, trofisk status, permeabel hud10,11, avhengighet av vann for reproduksjon12 og ubeskyttede egg11,13,14. Den lille vannfrosken (Physalaemus gracilis), ofte kjent som den gråtende frosken, har vist seg å være en bioindikatorart for plantevernmiddelforurensning4,5,6,7,15. Arten finnes i stående vann, beskyttede områder eller områder med varierende habitat i Argentina, Uruguay, Paraguay og Brasil1617 og anses som stabil av IUCN-klassifiseringen på grunn av dens brede utbredelse og toleranse for forskjellige habitater18.
Subletale effekter er rapportert hos amfibier etter eksponering for cypermetrin, inkludert atferdsmessige, morfologiske og biokjemiske endringer i rumpetroll23,24,25, endret dødelighet og metamorfosetid, enzymatiske endringer, redusert klekkingssuksess24,25, hyperaktivitet26, hemming av kolinesteraseaktivitet, endringer i svømmingsaktivitet,728. Studier av de genotoksiske effektene av cypermetrin hos amfibier er imidlertid begrenset. Derfor er det viktig å vurdere følsomheten til anuranarter for cypermetrin.
Miljøforurensning påvirker normal vekst og utvikling av amfibier, men den alvorligste bivirkningen er genetisk skade på DNA forårsaket av plantevernmiddeleksponering13. Blodcellemorfologianalyse er en viktig bioindikator på forurensning og potensiell toksisitet av et stoff for ville arter29. Mikronukleustesten er en av de mest brukte metodene for å bestemme genotoksisiteten til kjemikalier i miljøet30. Det er en rask, effektiv og rimelig metode som er en god indikator på kjemisk forurensning av organismer som amfibier31,32 og kan gi informasjon om eksponering for genotoksiske miljøgifter33.
Målet med denne studien var å evaluere det toksiske potensialet til kommersielle cypermetrinformuleringer til små akvatiske rumpetroll ved hjelp av en mikronukleustest og økologisk risikovurdering.
Kumulativ dødelighet (%) av P. gracilis rumpetroll eksponert for forskjellige konsentrasjoner av kommersielt cypermetrin i løpet av den akutte perioden av testen.
Kumulativ dødelighet (%) av P. gracilis rumpetroll utsatt for forskjellige konsentrasjoner av kommersielt cypermetrin under en kronisk test.
Den observerte høye dødeligheten var et resultat av genotoksiske effekter hos amfibier eksponert for forskjellige konsentrasjoner av cypermetrin (6 og 20 μg/L), noe som fremgår av tilstedeværelsen av mikrokjerner (MN) og nukleære abnormiteter i erytrocytter. Dannelse av MN indikerer feil i mitose og er assosiert med dårlig binding av kromosomer til mikrotubuli, defekter i proteinkomplekser som er ansvarlige for kromosomopptak og transport, feil i kromosomsegregering og feil i reparasjon av DNA-skader38,39 og kan være relatert til pesticid-indusert oksidativt stress40,41. Andre abnormiteter ble observert ved alle evaluerte konsentrasjoner. Økende cypermetrinkonsentrasjoner økte nukleære abnormiteter i erytrocytter med henholdsvis 5 % og 20 % ved de laveste (1 μg/L) og høyeste (20 μg/L) doser. For eksempel kan endringer i en arts DNA ha alvorlige konsekvenser for både kort- og langsiktig overlevelse, noe som resulterer i populasjonsnedgang, endret reproduksjonsevne, innavl, tap av genetisk mangfold og endrede migrasjonshastigheter. Alle disse faktorene kan påvirke arters overlevelse og vedlikehold42,43. Dannelsen av erytroide abnormiteter kan indikere en blokkering i cytokinese, noe som resulterer i unormal celledeling (binucleated erytrocytter)44,45; flerlobede kjerner er fremspring av kjernemembranen med flere lober46, mens andre erytroide abnormiteter kan være assosiert med DNA-amplifikasjon, slik som nukleære nyrer/blebs47. Tilstedeværelsen av anukleerte erytrocytter kan indikere nedsatt oksygentransport, spesielt i forurenset vann48,49. Apoptose indikerer celledød50.
Andre studier har også vist de genotoksiske effektene av cypermetrin. Kabaña et al.51 demonstrerte tilstedeværelsen av mikrokjerner og kjernefysiske endringer som binucleated celler og apoptotiske celler i Odontophrynus americanus celler etter eksponering for høye konsentrasjoner av cypermetrin (5000 og 10 000 μg L−1) i 96 timer. Cypermetrin-indusert apoptose ble også påvist i P. biligonigerus52 og Rhinella arenarum53. Disse resultatene tyder på at cypermetrin har genotoksiske effekter på en rekke vannlevende organismer og at MN- og ENA-analysen kan være en indikator på subletale effekter på amfibier og kan være anvendelig på innfødte arter og ville populasjoner som er utsatt for giftstoffer12.
Kommersielle formuleringer av cypermetrin utgjør en høy miljøfare (både akutt og kronisk), med HQs som overskrider nivået av US Environmental Protection Agency (EPA)54 som kan påvirke arten negativt hvis de er til stede i miljøet. I den kroniske risikovurderingen var NOEC for dødelighet 3 μg L−1, noe som bekrefter at konsentrasjonene funnet i vann kan utgjøre en risiko for arten55. Den dødelige NOEC for R. arenarum-larver eksponert for en blanding av endosulfan og cypermetrin var 500 μg L−1 etter 168 timer; denne verdien sank til 0,0005 μg L−1 etter 336 timer. Forfatterne viser at jo lengre eksponering, jo lavere er konsentrasjonene som er skadelige for arten. Det er også viktig å fremheve at NOEC-verdiene var høyere enn for P. gracilis ved samme eksponeringstid, noe som indikerer at artsresponsen på cypermetrin er artsspesifikk. Videre, når det gjelder dødelighet, nådde CHQ-verdien til P. gracilis etter eksponering for cypermetrin 64,67, som er høyere enn referanseverdien satt av US Environmental Protection Agency54, og CHQ-verdien til R. arenarum-larvene var også høyere enn denne verdien (CHQ > 388,00 etter 336 timer), noe som tyder på at flere arter har en høy risiko for amphibiske studier. Tatt i betraktning at P. gracilis krever omtrent 30 dager for å fullføre metamorfose56, kan det konkluderes med at de studerte konsentrasjonene av cypermetrin kan bidra til populasjonsnedgang ved å hindre infiserte individer fra å gå inn i voksen- eller reproduktivt stadium i en tidlig alder.
I den beregnede risikovurderingen av mikrokjerner og andre kjernefysiske abnormiteter i erytrocytter varierte CHQ-verdiene fra 14,92 til 97,00, noe som indikerer at cypermetrin hadde en potensiell genotoksisk risiko for P. gracilis selv i dets naturlige habitat. Tar dødeligheten i betraktning, var den maksimale konsentrasjonen av xenobiotiske forbindelser som kan tolereres for P. gracilis 4,24 μg L−1. Konsentrasjoner så lave som 1 μg/L viste imidlertid også genotoksiske effekter. Dette faktum kan føre til en økning i antall unormale individer57 og påvirke utviklingen og reproduksjonen av arter i deres habitater, noe som fører til en nedgang i amfibiebestandene.
Kommersielle formuleringer av insektmiddelet cypermetrin viste høy akutt og kronisk toksisitet for P. gracilis. Høyere dødelighetsrater ble observert, sannsynligvis på grunn av toksiske effekter, som bevist av tilstedeværelsen av mikrokjerner og erytrocytt-kjerneavvik, spesielt taggete kjerner, flikete kjerner og vesikulære kjerner. I tillegg viste de studerte artene økt miljørisiko, både akutt og kronisk. Disse dataene, kombinert med tidligere studier av vår forskergruppe, viste at selv ulike kommersielle formuleringer av cypermetrin fortsatt forårsaket redusert acetylkolinesterase (AChE) og butyrylkolinesterase (BChE) aktiviteter og oksidativt stress58, og resulterte i endringer i svømmeaktivitet og orale misdannelser59 hos P. gracilis, noe som indikerer at kommersielle subformuleringer av lethalpermethrin har høy halt av lethalpermethrin. Hartmann et al. 60 fant at kommersielle formuleringer av cypermetrin var de mest giftige for P. gracilis og en annen art av samme slekt (P. cuvieri) sammenlignet med ni andre plantevernmidler. Dette antyder at lovlig godkjente konsentrasjoner av cypermetrin for miljøvern kan føre til høy dødelighet og langsiktig befolkningsnedgang.
Ytterligere studier er nødvendig for å vurdere giftigheten av plantevernmiddelet for amfibier, da konsentrasjonene som finnes i miljøet kan forårsake høy dødelighet og utgjøre en potensiell risiko for P. gracilis. Forskning på amfibiearter bør oppmuntres, da data om disse organismene er knappe, spesielt om brasilianske arter.
Den kroniske toksisitetstesten varte i 168 timer (7 dager) under statiske forhold og de subletale konsentrasjonene var: 1, 3, 6 og 20 μg ai L−1. I begge forsøkene ble 10 rumpetroll per behandlingsgruppe evaluert med seks replikater, for totalt 60 rumpetroll per konsentrasjon. I mellomtiden fungerte behandlingen med kun vann som en negativ kontroll. Hvert forsøksoppsett besto av en steril glassskål med en kapasitet på 500 ml og en tetthet på 1 rumpetroll per 50 ml løsning. Kolben ble dekket med polyetylenfilm for å forhindre fordampning og ble kontinuerlig luftet.
Vannet ble kjemisk analysert for å bestemme plantevernmiddelkonsentrasjoner ved 0, 96 og 168 timer. I følge Sabin et al. 68 og Martins et al. 69 ble analysene utført ved Pesticide Analysis Laboratory (LARP) ved Federal University of Santa Maria ved bruk av gasskromatografi koblet til trippel kvadrupol massespektrometri (Varian modell 1200, Palo Alto, California, USA). Den kvantitative bestemmelsen av plantevernmidler i vann er vist som tilleggsmateriale (tabell SM1).
For mikronukleus-testen (MNT) og røde celle nukleær abnormalitetstest (RNA) ble 15 rumpetroll fra hver behandlingsgruppe analysert. Rumpetroll ble bedøvet med 5 % lidokain (50 mg g-170) og blodprøver ble tatt ved hjertepunktur ved bruk av hepariniserte engangssprøyter. Blodstryk ble preparert på sterile objektglass, lufttørket, fiksert med 100 % metanol (4 °C) i 2 minutter og deretter farget med 10 % Giemsa-løsning i 15 minutter i mørket. På slutten av prosessen ble objektglassene vasket med destillert vann for å fjerne overflødig flekk og tørket ved romtemperatur.
Minst 1000 røde blodceller fra hver rumpetroll ble analysert ved hjelp av et 100× mikroskop med et 71-objektiv for å bestemme tilstedeværelsen av MN og ENA. Totalt 75 796 røde blodceller fra rumpetroll ble evaluert med tanke på cypermetrinkonsentrasjoner og kontroller. Genotoksisitet ble analysert i henhold til metoden til Carrasco et al. og Fenech et al.38,72 ved å bestemme hyppigheten av følgende kjernelesjoner: (1) anukleære celler: celler uten kjerne; (2) apoptotiske celler: kjernefragmentering, programmert celledød; (3) binukleære celler: celler med to kjerner; (4) kjerneknopper eller blebceller: celler med kjerner med små fremspring i kjernemembranen, blemmer av samme størrelse som mikrokjerner; (5) karyolyserte celler: celler med kun omrisset av kjernen uten indre materiale; (6) hakkceller: celler med kjerner med tydelige sprekker eller hakk i formen, også kalt nyreformede kjerner; (7) lobulerte celler: celler med kjernefremspring større enn de ovennevnte vesiklene; og (8) mikroceller: celler med kondenserte kjerner og redusert cytoplasma. Endringene ble sammenlignet med de negative kontrollresultatene.
Testresultatene for akutt toksisitet (LC50) ble analysert ved bruk av GBasic-programvare og TSK-Trimmed Spearman-Karber-metoden74. De kroniske testdataene ble forhåndstestet for feilnormalitet (Shapiro-Wilks) og varianshomogenitet (Bartlett). Resultatene ble analysert ved bruk av enveis variansanalyse (ANOVA). Tukeys test ble brukt til å sammenligne data seg imellom, og Dunnetts test ble brukt til å sammenligne data mellom behandlingsgruppen og den negative kontrollgruppen.
LOEC- og NOEC-data ble analysert ved hjelp av Dunnetts test. Statistiske tester ble utført ved bruk av programvaren Statistica 8.0 (StatSoft) med et signifikansnivå på 95 % (p < 0,05).
Innleggstid: 13. mars 2025