Fosforylering aktiverer den viktigste vekstregulatoren DELLA, og fremmer binding av histon H2A til kromatin i Arabidopsis.

DELLA-proteiner er konservertevekstregulatorersom spiller en sentral rolle i planteutvikling som respons på interne og eksterne signaler. Som transkripsjonsregulatorer binder DELLA-er seg til transkripsjonsfaktorer (TF-er) og histon H2A via sine GRAS-domener og rekrutteres til å virke på promotorer. Nyere studier har vist at DELLA-stabilitet reguleres posttranslasjonelt av to mekanismer: polyubikvitinering indusert av plantehormonetgibberellin, noe som fører til rask nedbrytning, og konjugering med liten ubiquitinlignende modifikator (SUMO), noe som øker akkumuleringen. Dessuten reguleres DELLA-aktivitet dynamisk av to distinkte glykosyleringsmekanismer: O-fukosylering forsterker DELLA-TF-interaksjon, mens O-bundet N-acetylglukosamin (O-GlcNAc)-modifikasjon hemmer DELLA-TF-interaksjon. Rollen til DELLA-fosforylering er imidlertid uklar, da tidligere studier har vist motstridende resultater, hvor noen antyder at fosforylering fremmer eller undertrykker DELLA-nedbrytning, og andre antyder at fosforylering ikke påvirker stabiliteten deres. Her identifiserer vi fosforyleringssteder i GA1-3-repressoren (RGA), AtDELLA, renset fra Arabidopsis thaliana ved massespektrometri, og viser at fosforylering av to RGA-peptider i PolyS- og PolyS/T-regionene forsterker RGA-aktivitet ved å fremme H2A-binding og RGA-assosiasjon med målpromotorer. Det er verdt å merke seg at fosforylering ikke påvirket RGA-TF-interaksjoner eller RGA-stabilitet. Studien vår avslører en molekylær mekanisme der fosforylering induserer DELLA-aktivitet.
Vår massespektrometriske analyse viste at både Pep1 og Pep2 var sterkt fosforylert i RGA i den GA-defekte Ga1-bakgrunnen. I tillegg til denne studien har fosfoproteomiske studier også avslørt Pep1-fosforylering i RGA, selv om dens rolle ennå ikke er studert53,54,55. I motsetning til dette har ikke Pep2-fosforylering blitt beskrevet tidligere, siden dette peptidet bare kunne detekteres ved bruk av RGAGKG-transgenet. Selv om m1A-mutasjonen, som avskaffet Pep1-fosforylering, bare reduserte RGA-aktiviteten litt i planta, hadde den en additiv effekt når den ble kombinert med m2A i å redusere RGA-aktivitet (tilleggsfigur 6). Viktigere er det at Pep1-fosforylering var betydelig redusert i den GA-forsterkede sly1-mutanten sammenlignet med ga1, noe som tyder på at GA fremmer RGA-defosforylering og reduserer dens aktivitet. Mekanismen der GA undertrykker RGA-fosforylering krever ytterligere undersøkelse. En mulighet er at dette oppnås gjennom regulering av en uidentifisert proteinkinase. Selv om studier har vist at uttrykk av CK1-proteinkinase EL1 er nedregulert av GA i ris41, indikerer resultatene våre at høyereordensmutasjoner av Arabidopsis EL1-homologen (AEL1-4) ikke reduserer RGA-fosforylering. I samsvar med resultatene våre identifiserte ikke en nylig fosfoproteomisk studie med Arabidopsis AEL-overuttrykkende linjer og en ael-trippelmutant noen DELLA-proteiner som substrater for disse kinasene56. Da vi utarbeidet manuskriptet, ble det rapportert at GSK3, genet som koder for en GSK3/SHAGGY-lignende kinase i hvete (Triticum aestivum), kan fosforylere DELLA (Rht-B1b)57, selv om fosforylering av Rht-B1b av GSK3 ikke er bekreftet in planta. In vitro enzymatiske reaksjoner i nærvær av GSK3 etterfulgt av massespektrometrianalyse avdekket tre fosforyleringssteder lokalisert mellom DELLA- og GRAS-domenene til Rht-B1b (tilleggsfigur 3). Serin- til alanin-substitusjoner på alle tre fosforyleringsstedene resulterte i redusert Rht-B1b-aktivitet i transgen hvete, i samsvar med våre funn om at alanin-substitusjoner i Pep2 RGA reduserte RGA-aktivitet. Imidlertid viste in vitro-proteinnedbrytningsanalyser videre at fosforylering også kan stabilisere Rht-B1b57. Dette står i kontrast til våre resultater som viser at alanin-substitusjoner i Pep2 RGA ikke endrer dens stabilitet in planta. GSK3 i hvete er en ortolog av brassinosteroid-ufølsomt protein 2 (BIN2) i Arabidopsis57. BIN2 er en negativ regulator av BR-signalering, og BR aktiverer signalveien ved å forårsake BIN2-nedbrytning58. Vi viste at BR-behandling ikke reduserer RGA-stabilitet59 eller fosforyleringsnivåer i Arabidopsis (tilleggsfigur 2), noe som tyder på at RGA sannsynligvis ikke blir fosforylert av BIN2.
Alle kvantitative data ble statistisk analysert ved hjelp av Excel, og signifikante forskjeller ble bestemt ved hjelp av Students t-test. Ingen statistiske metoder ble brukt til å forhåndsbestemme utvalgsstørrelsen. Ingen data ble ekskludert fra analysen; eksperimentet var ikke randomisert; og forskerne var klar over fordelingen under eksperimentet og resultatvurderingen. Utvalgsstørrelsene er oppgitt i figurforklaringene og i rådatafilene.