DELLA-proteiner er bevartvekstregulatorersom spiller en sentral rolle i planteutvikling som svar på interne og eksterne signaler. Som transkripsjonsregulatorer binder DELLA-er seg til transkripsjonsfaktorer (TF-er) og histon H2A via deres GRAS-domener og rekrutteres til å virke på promotere. Nyere studier har vist at DELLA-stabilitet reguleres post-translasjonelt av to mekanismer: polyubiquitinering indusert av plantehormonetgibberellin, noe som fører til deres raske nedbrytning, og konjugering med liten ubiquitin-lignende modifiseringsmiddel (SUMO), som øker deres akkumulering. Dessuten er DELLA-aktivitet dynamisk regulert av to distinkte glykosyleringsmekanismer: O-fukosylering forbedrer DELLA-TF-interaksjon, mens O-bundet N-acetylglukosamin (O-GlcNAc) modifikasjon hemmer DELLA-TF-interaksjon. Rollen til DELLA-fosforylering er imidlertid uklar ettersom tidligere studier har vist motstridende resultater, hvor noen antyder at fosforylering fremmer eller undertrykker DELLA-nedbrytning og andre antyder at fosforylering ikke påvirker stabiliteten deres. Her identifiserer vi fosforyleringssteder i GA1-3-repressoren (RGA), AtDELLA, renset fra Arabidopsis thaliana ved massespektrometri og viser at fosforylering av to RGA-peptider i PolyS- og PolyS/T-regionene forbedrer RGA-aktivitet ved å fremme H2A-binding og RGA-assosiasjon med målpromotere. Spesielt påvirket ikke fosforylering RGA-TF-interaksjoner eller RGA-stabilitet. Vår studie avslører en molekylær mekanisme der fosforylering induserer DELLA-aktivitet.
Vår massespektrometriske analyse viste at både Pep1 og Pep2 var sterkt fosforylert i RGA i den GA-mangelfulle Ga1-bakgrunnen. I tillegg til denne studien har fosfoproteomiske studier også avslørt Pep1-fosforylering i RGA, selv om dens rolle ennå ikke er studert53,54,55. I motsetning til dette er Pep2-fosforylering ikke tidligere beskrevet siden dette peptidet bare kunne påvises ved å bruke RGAGKG-transgenet. Selv om m1A-mutasjonen, som opphevet Pep1-fosforylering, bare reduserte RGA-aktivitet i planta litt, hadde den en additiv effekt når den ble kombinert med m2A for å redusere RGA-aktivitet (tilleggsfigur 6). Det er viktig at Pep1-fosforylering ble betydelig redusert i den GA-forbedrede sly1-mutanten sammenlignet med ga1, noe som tyder på at GA fremmer RGA-defosforylering, og reduserer aktiviteten. Mekanismen som GA undertrykker RGA-fosforylering krever ytterligere undersøkelser. En mulighet er at dette oppnås gjennom regulering av en uidentifisert proteinkinase. Selv om studier har vist at uttrykk for CK1-proteinkinase EL1 nedreguleres av GA i ris41, indikerer resultatene våre at høyere ordens mutasjoner av Arabidopsis EL1-homologen (AEL1-4) ikke reduserer RGA-fosforylering. I samsvar med resultatene våre, identifiserte ikke en nylig fosfoproteomisk studie med Arabidopsis AEL-overuttrykkende linjer og en ael trippelmutant noen DELLA-proteiner som substrater for disse kinasene56. Da vi utarbeidet manuskriptet, ble det rapportert at GSK3, genet som koder for en GSK3/SHAGGY-lignende kinase i hvete (Triticum aestivum), kan fosforylere DELLA (Rht-B1b)57, selv om fosforylering av Rht-B1b av GSK3 ikke har blitt bekreftet i planta. Enzymatiske reaksjoner in vitro i nærvær av GSK3 etterfulgt av massespektrometrianalyse avslørte tre fosforyleringssteder lokalisert mellom DELLA- og GRAS-domenene til Rht-B1b (tilleggsfig. 3). Serin til alanin-substitusjoner på alle de tre fosforyleringsstedene resulterte i redusert Rht-B1b-aktivitet i transgen hvete, i samsvar med funnene våre om at alanin-substitusjoner i Pep2 RGA reduserte RGA-aktivitet. Imidlertid viste in vitro proteinnedbrytningsanalyser videre at fosforylering også kan stabilisere Rht-B1b57. Dette er i motsetning til resultatene våre som viser at alaninsubstitusjoner i Pep2 RGA ikke endrer stabiliteten i planta. GSK3 i hvete er en ortolog av brassinosteroid-ufølsomt protein 2 (BIN2) i Arabidopsis 57. BIN2 er en negativ regulator av BR-signalering, og BR aktiverer sin signalvei ved å forårsake BIN2-nedbrytning 58. Vi viste at BR-behandling ikke reduserer RGA-stabilitet 59 eller arabidolementær psi, phosphorarypsis, antyder at RGA er usannsynlig å bli fosforylert av BIN2.
Alle kvantitative data ble statistisk analysert ved bruk av Excel, og signifikante forskjeller ble bestemt ved hjelp av Students t-test. Ingen statistiske metoder ble brukt for å forhåndsbestemme prøvestørrelse. Ingen data ble ekskludert fra analysen; eksperimentet ble ikke randomisert; og forskerne var klar over tildelingen under eksperimentet og utfallsvurderingen. Prøvestørrelser er gitt i figurforklaringene og i rådatafilene.
Innleggstid: 15. april 2025