Plantevekstregulatorer har blitt brukt som en strategi for å redusere varmestress i ulike avlinger

Risproduksjonen går ned på grunn av klimaendringer og variasjon i Colombia.Plantevekstregulatorerhar blitt brukt som en strategi for å redusere varmestress i ulike avlinger. Derfor var målet med denne studien å evaluere de fysiologiske effektene (stomatal konduktans, stomatal konduktans, totalt klorofyllinnhold, Fv/Fm-forhold mellom to kommersielle risgenotyper utsatt for kombinert varmestress (høy dag- og natttemperatur), baldakintemperatur og relativt vanninnhold) og biokjemiske variabler (malondialdehyd (MDA) og prolinsyreinnhold). Det første og andre forsøket ble utført ved bruk av planter av to risgenotyper, henholdsvis Federrose 67 ("F67") og Federrose 2000 ("F2000"). Begge eksperimentene ble analysert sammen som en serie av eksperimenter. De etablerte behandlingene var som følger: absolutt kontroll (AC) (risplanter dyrket ved optimale temperaturer (dag/natt temperatur 30/25°C)), varmestresskontroll (SC) [risplanter utsatt for kun kombinert varmestress (40/25°C). 30°C)], og risplanter ble stresset og sprayet med plantevekstregulatorer (stress+AUX, stress+BR, stress+CK eller stress+GA) to ganger (5 dager før og 5 dager etter varmestress). Sprøyting med SA økte det totale klorofyllinnholdet til begge variantene (ferskvekten av risplanter "F67" og "F2000" var henholdsvis 3,25 og 3,65 mg/g) sammenlignet med SC-planter (ferskvekt av "F67"-planter var 2,36 og 2-12)0 mg og 2-16 g)0 mg. bladpåføring av CK forbedret også generelt stomatal ledningsevnen til "F2000" risplanter (499,25 vs. 150,60 mmol m-2 s) sammenlignet med varmestresskontrollen. varmestress, temperaturen på plantekronen synker med 2–3 °C, og MDA-innholdet i planter synker. Den relative toleranseindeksen viser at bladpåføring av CK (97,69 %) og BR (60,73 %) kan bidra til å lindre problemet med kombinert varme. stress hovedsakelig i F2000 risplanter. Avslutningsvis kan bladsprøyting av BR eller CK betraktes som en agronomisk strategi for å bidra til å redusere de negative effektene av kombinerte varmestressforhold på den fysiologiske oppførselen til risplanter.
Ris (Oryza sativa) tilhører Poaceae-familien og er en av de mest dyrkede kornene i verden sammen med mais og hvete (Bajaj og Mohanty, 2005). Arealet under risdyrking er 617 934 hektar, og den nasjonale produksjonen i 2020 var 2 937 840 tonn med en gjennomsnittlig avling på 5,02 tonn/ha (Federarroz (Federación Nacional de Arroceros), 2021).
Global oppvarming påvirker risavlingene, noe som fører til ulike typer abiotisk stress som høye temperaturer og tørkeperioder. Klimaendringer får globale temperaturer til å stige; Temperaturene anslås å stige med 1,0–3,7 °C i det 21. århundre, noe som kan øke hyppigheten og intensiteten av varmestress. Økte miljøtemperaturer har påvirket ris, noe som har ført til at avlingene har gått ned med 6–7 %. På den annen side fører klimaendringer også til ugunstige miljøforhold for avlinger, som perioder med alvorlig tørke eller høye temperaturer i tropiske og subtropiske områder. I tillegg kan variasjonshendelser som El Niño føre til varmestress og forverre avlingsskader i enkelte tropiske områder. I Colombia anslås temperaturen i risproduserende områder å øke med 2–2,5 °C innen 2050, noe som reduserer risproduksjonen og påvirker produktstrømmene til markeder og forsyningskjeder.
De fleste risvekster dyrkes i områder der temperaturene er nær det optimale området for avlingsvekst (Shah et al., 2011). Det har blitt rapportert at de optimale gjennomsnittlige dag- og natttemperaturene forris vekst og utviklinger generelt henholdsvis 28°C og 22°C (Kilasi et al., 2018; Calderón-Páez et al., 2021). Temperaturer over disse tersklene kan forårsake perioder med moderat til alvorlig varmestress under sensitive stadier av risutvikling (tilling, antese, blomstring og kornfylling), og dermed påvirke kornutbyttet negativt. Denne reduksjonen i avling skyldes hovedsakelig lange perioder med varmestress, som påvirker plantefysiologien. På grunn av samspillet mellom ulike faktorer, som stressvarighet og maksimal temperatur nådd, kan varmestress forårsake en rekke irreversible skader på plantemetabolisme og utvikling.
Varmestress påvirker ulike fysiologiske og biokjemiske prosesser i planter. Bladfotosyntese er en av prosessene som er mest utsatt for varmestress i risplanter, siden fotosyntesehastigheten avtar med 50 % når daglige temperaturer overstiger 35 °C. Fysiologiske responser fra risplanter varierer avhengig av typen varmestress. For eksempel hemmes fotosyntesehastigheter og stomatal ledningsevne når planter utsettes for høye dagtemperaturer (33–40 °C) eller høye dag- og natttemperaturer (35–40 °C på dagtid, 28–30 °C). C betyr natt) (Lü et al., 2013; Fahad et al., 2016; Chaturvedi et al., 2017). Høye nattetemperaturer (30°C) forårsaker moderat hemming av fotosyntesen, men øker nattåndingen (Fahad et al., 2016; Alvarado-Sanabria et al., 2017). Uavhengig av stressperioden, påvirker varmestress også bladklorofyllinnholdet, forholdet mellom klorofyll variabel fluorescens og maksimal klorofyllfluorescens (Fv/Fm), og Rubisco-aktivering i risplanter (Cao et al. 2009; Yin et al. 2010). ) Sanchez Reynoso et al., 2014).
Biokjemiske endringer er et annet aspekt ved plantens tilpasning til varmestress (Wahid et al., 2007). Prolininnhold har blitt brukt som en biokjemisk indikator på plantestress (Ahmed og Hassan 2011). Prolin spiller en viktig rolle i plantemetabolisme siden det fungerer som en karbon- eller nitrogenkilde og som en membranstabilisator under høye temperaturforhold (Sánchez-Reinoso et al., 2014). Høye temperaturer påvirker også membranstabiliteten gjennom lipidperoksidasjon, noe som fører til dannelse av malondialdehyd (MDA) (Wahid et al., 2007). Derfor har MDA-innhold også blitt brukt for å forstå den strukturelle integriteten til cellemembraner under varmestress (Cao et al., 2009; Chavez-Arias et al., 2018). Til slutt økte kombinert varmestress [37/30°C (dag/natt)] prosentandelen av elektrolyttlekkasje og malondialdehydinnhold i ris (Liu et al., 2013).
Bruken av plantevekstregulatorer (GR) er vurdert til å dempe de negative effektene av varmestress, da disse stoffene er aktivt involvert i planteresponser eller fysiologiske forsvarsmekanismer mot slikt stress (Peleg og Blumwald, 2011; Yin et al. et al., 2011; Ahmed et al., 2015). Eksogen anvendelse av genetiske ressurser har hatt en positiv effekt på varmestresstoleransen i ulike avlinger. Studier har vist at fytohormoner som gibberelliner (GA), cytokininer (CK), auxiner (AUX) eller brassinosteroider (BR) fører til en økning i ulike fysiologiske og biokjemiske variabler (Peleg og Blumwald, 2011; Yin et al. Ren, 2011; Mitler et al., Zhou et al., Zhou et al., 2012). I Colombia har ikke eksogen anvendelse av genetiske ressurser og dens innvirkning på risavlinger blitt fullstendig forstått og studert. En tidligere studie viste imidlertid at bladsprøyting av BR kunne forbedre ristoleransen ved å forbedre gassutvekslingsegenskapene, klorofyll- eller prolininnholdet i risfrøplanteblader (Quintero-Calderón et al., 2021).
Cytokininer medierer planteresponser på abiotisk stress, inkludert varmestress (Ha et al., 2012). I tillegg er det rapportert at eksogen påføring av CK kan redusere termisk skade. For eksempel økte eksogen påføring av zeatin fotosyntesehastigheten, klorofyll a og b-innholdet og elektrontransporteffektiviteten i krypende buktgress (Agrotis estolonifera) under varmestress (Xu og Huang, 2009; Jespersen og Huang, 2015). Eksogen påføring av zeatin kan også forbedre antioksidantaktivitet, forbedre syntesen av ulike proteiner, redusere skader på reaktive oksygenarter (ROS) og produksjon av malondialdehyd (MDA) i plantevev (Chernyadyev, 2009; Yang et al., 2009). , 2016; Kumar et al., 2020).
Bruken av gibberellinsyre har også vist en positiv respons på varmestress. Studier har vist at GA-biosyntese medierer ulike metabolske veier og øker toleransen under høye temperaturforhold (Alonso-Ramirez et al. 2009; Khan et al. 2020). Abdel-Nabi et al. (2020) fant at bladsprøyting av eksogen GA (25 eller 50 mg*L) kunne øke fotosyntesehastigheten og antioksidantaktiviteten i varmestressede appelsinplanter sammenlignet med kontrollplanter. Det har også blitt observert at eksogen påføring av HA øker det relative fuktighetsinnholdet, klorofyll- og karotenoidinnholdet og reduserer lipidperoksidasjon i daddelpalme (Phoenix dactylifera) under varmestress (Khan et al., 2020). Auxin spiller også en viktig rolle i å regulere adaptive vekstresponser til høye temperaturforhold (Sun et al., 2012; Wang et al., 2016). Denne vekstregulatoren fungerer som en biokjemisk markør i ulike prosesser som prolinsyntese eller nedbrytning under abiotisk stress (Ali et al. 2007). I tillegg øker AUX også antioksidantaktivitet, noe som fører til en reduksjon i MDA i planter på grunn av redusert lipidperoksidasjon (Bielach et al., 2017). Sergeev et al. (2018) observerte at i erteplanter (Pisum sativum) under varmestress øker innholdet av prolin – dimetylaminoetoksykarbonylmetyl)naftylklormetyleter (TA-14). I det samme forsøket observerte de også lavere nivåer av MDA i behandlede planter sammenlignet med planter som ikke var behandlet med AUX.
Brassinosteroider er en annen klasse av vekstregulatorer som brukes til å dempe effekten av varmestress. Ogweno et al. (2008) rapporterte at eksogen BR-spray økte netto fotosyntesehastighet, stomatal ledningsevne og maksimal rate av Rubisco-karboksylering av tomatplanter (Solanum lycopersicum) under varmestress i 8 dager. Bladsprøyting av epibrassinosteroider kan øke netto fotosyntesehastigheten til agurkplanter (Cucumis sativus) under varmestress (Yu et al., 2004). I tillegg forsinker eksogen påføring av BR klorofyllnedbrytning og øker vannbrukseffektiviteten og maksimalt kvanteutbytte av PSII-fotokjemi i planter under varmestress (Holá et al., 2010; Toussagunpanit et al., 2015).
På grunn av klimaendringer og variasjon møter risavlinger perioder med høye daglige temperaturer (Lesk et al., 2016; Garcés, 2020; Federarroz (Federación Nacional de Arroceros), 2021). Ved plantefenotyping har bruken av fytonæringsstoffer eller biostimulanter blitt studert som en strategi for å dempe varmestress i risdyrkende områder (Alvarado-Sanabria et al., 2017; Calderón-Páez et al., 2021; Quintero-Calderón et al., 2021). I tillegg er bruken av biokjemiske og fysiologiske variabler (bladtemperatur, stomatal konduktans, klorofyllfluorescensparametere, klorofyll og relativt vanninnhold, malondialdehyd og prolinsyntese) et pålitelig verktøy for å screene risplanter under varmestress lokalt og internasjonalt (Sánchez -Reynoso et al., Alvara al.S., 201. S., 201, 01; Forskning på bruk av bladfytohormonelle sprayer på lokalt nivå er derfor sjeldne. Derfor er studiet av de fysiologiske og biokjemiske reaksjonene ved bruk av plantevekstregulatorer av stor betydning for forslaget om praktiske agronomiske strategier for å adressere de negative effektene av en periode med kompleks varmestress i ris, derfor var formålet med denne fysiologiske studien fluorescensparametere og relativt vanninnhold) og biokjemiske effekter av bladpåføring av fire plantevekstregulatorer (AUX, CK, GA og BR). (Fotosyntetiske pigmenter, malondialdehyd og prolininnhold) Variabler i to kommersielle risgenotyper utsatt for kombinert varmestress (høy dag/natt-temperatur).
I denne studien ble det utført to uavhengige eksperimenter. Genotypene Federrose 67 (F67: en genotype utviklet i høye temperaturer i løpet av det siste tiåret) og Federrose 2000 (F2000: en genotype utviklet i siste tiår av 1900-tallet som viser resistens mot hvitbladvirus) ble brukt for første gang. frø. og det andre eksperimentet, henholdsvis. Begge genotypene er mye dyrket av colombianske bønder. Frø ble sådd i 10-L brett (lengde 39,6 cm, bredde 28,8 cm, høyde 16,8 cm) inneholdende sandholdig leirjord med 2% organisk materiale. Fem forhåndsspirede frø ble plantet i hvert brett. Pallene ble plassert i drivhuset til fakultetet for landbruksvitenskap ved National University of Colombia, Bogotá campus (43°50′56″ N, 74°04′051″ W), i en høyde av 2556 m over havet. m.) og ble utført fra oktober til desember 2019. Ett eksperiment (Federroz 67) og et andre eksperiment (Federroz 2000) i samme sesong av 2020.
Miljøforholdene i drivhuset i hver plantesesong er som følger: dag- og natttemperatur 30/25°C, relativ fuktighet 60~80%, naturlig fotoperiode 12 timer (fotosyntetisk aktiv stråling 1500 µmol (fotoner) m-2 s-). 1 ved middagstid). Planter ble gjødslet i henhold til innholdet av hvert element 20 dager etter frøfremvekst (DAE), ifølge Sánchez-Reinoso et al. (2019): 670 mg nitrogen per plante, 110 mg fosfor per plante, 350 mg kalium per plante, 68 mg kalsium per plante, 20 mg magnesium per plante, 20 mg svovel per plante, 17 mg silisium per plante. Plantene inneholder 10 mg bor per plante, 17 mg kobber per plante, og 44 mg sink per plante. Risplanter ble holdt på opptil 47 DAE i hvert eksperiment når de nådde fenologisk stadium V5 i løpet av denne perioden. Tidligere studier har vist at dette fenologiske stadiet er et passende tidspunkt for å gjennomføre varmestressstudier i ris (Sánchez-Reinoso et al., 2014; Alvarado-Sanabria et al., 2017).
I hvert eksperiment ble det utført to separate påføringer av bladvekstregulatoren. Det første settet med bladfytohormonsprayer ble påført 5 dager før varmestressbehandlingen (42 DAE) for å forberede plantene for miljøstress. En andre bladspray ble deretter gitt 5 dager etter at plantene ble utsatt for stressforhold (52 DAE). Fire fytohormoner ble brukt og egenskapene til hver aktiv ingrediens sprayet i denne studien er oppført i tilleggstabell 1. Konsentrasjonene av bladvekstregulatorer som ble brukt var som følger: (i) Auxin (1-naftyleddiksyre: NAA) i en konsentrasjon på 5 × 10−5 M (ii) 5 × 10–5 M gibberellinsyre; GA3); (iii) Cytokinin (trans-zeatin) 1 x 10-5 M (iv) Brassinosteroider [Spirostan-6-on, 3,5-dihydroksy-, (3b,5a,25R)] 5 x 10-5; M. Disse konsentrasjonene ble valgt fordi de induserer positive responser og øker plantenes motstand mot varmestress (Zahir et al., 2001; Wen et al., 2010; El-Bassiony et al., 2012; Salehifar et al., 2017). Risplanter uten plantevekstregulerende spray ble kun behandlet med destillert vann. Alle risplanter ble sprøytet med en håndsprøyte. Påfør 20 ml H2O på planten for å fukte den øvre og nedre overflaten av bladene. Alle bladsprayer brukte landbruksadjuvans (Agrotin, Bayer CropScience, Colombia) ved 0,1 % (v/v). Avstanden mellom potten og sprøyten er 30 cm.
Varmestressbehandlinger ble administrert 5 dager etter den første bladsprayen (47 DAE) i hvert eksperiment. Risplanter ble overført fra drivhuset til et 294 L vekstkammer (MLR-351H, Sanyo, IL, USA) for å etablere varmestress eller opprettholde de samme miljøforholdene (47 DAE). Kombinert varmestressbehandling ble utført ved å sette kammeret til følgende dag/natt-temperaturer: dagtid høy temperatur [40°C i 5 timer (fra 11:00 til 16:00)] og nattperiode [30°C i 5 timer]. 8 dager på rad (fra 19:00 til 24:00). Stresstemperaturen og eksponeringstiden ble valgt basert på tidligere studier (Sánchez-Reynoso et al. 2014; Alvarado-Sanabría et al. 2017). På den annen side ble en gruppe planter overført til vekstkammeret holdt i drivhuset ved samme temperatur (30°C om dagen/25°C om natten) i 8 påfølgende dager.
På slutten av eksperimentet ble følgende behandlingsgrupper oppnådd: (i) veksttemperaturtilstand + påføring av destillert vann [Absolutt kontroll (AC)], (ii) varmestresstilstand + påføring av destillert vann [Varmestresskontroll (SC)], (iii) betingelser varmestresstilstand + auxinpåføring (AUX), (iv) varmestresstilstand + gibberellinpåføring (GA), (v) varmestresstilstand + cytovipåføringsstresstilstand (Cytovi) brassinosteroid (BR) vedlegg. Disse behandlingsgruppene ble brukt for to genotyper (F67 og F2000). Alle behandlinger ble utført i et fullstendig randomisert design med fem replikater, hver bestående av en plante. Hver plante ble brukt til å lese ut variablene som ble bestemt på slutten av eksperimentet. Eksperimentet varte i 55 DAE.
Stomatal konduktans (gs) ble målt ved bruk av et bærbart porosometer (SC-1, METER Group Inc., USA) i området fra 0 til 1000 mmol m-2 s-1, med en prøvekammeråpning på 6,35 mm. Målinger gjøres ved å feste en stomametersonde til et modent blad med plantens hovedskudd helt ekspandert. For hver behandling ble gs-avlesninger tatt på tre blader av hver plante mellom kl. 11.00 og 16.00 og beregnet gjennomsnitt.
RWC ble bestemt i henhold til metoden beskrevet av Ghoulam et al. (2002). Det fullt utvidede arket som ble brukt til å bestemme g ble også brukt til å måle RWC. Ferskvekt (FW) ble bestemt umiddelbart etter høsting ved bruk av en digital vekt. Bladene ble deretter plassert i en plastbeholder fylt med vann og stående i mørke ved romtemperatur (22°C) i 48 timer. Vei deretter på en digital vekt og registrer den utvidede vekten (TW). De hovne bladene ble ovnstørket ved 75°C i 48 timer og deres tørrvekt (DW) ble registrert.
Relativt klorofyllinnhold ble bestemt ved hjelp av et klorofyllmåler (atLeafmeter, FT Green LLC, USA) og uttrykt i atLeaf-enheter (Dey et al., 2016). PSII maksimale kvanteeffektivitetsavlesninger (Fv/Fm-forhold) ble registrert ved bruk av et kontinuerlig eksitasjonsklorofyllfluorimeter (Handy PEA, Hansatech Instruments, UK). Bladene ble mørketilpasset ved bruk av bladklemmer i 20 min før Fv/Fm-målinger (Restrepo-Diaz og Garces-Varon, 2013). Etter at bladene var mørkeakklimatiserte, ble baseline (F0) og maksimal fluorescens (Fm) målt. Fra disse dataene ble variabel fluorescens (Fv = Fm – F0), forholdet mellom variabel fluorescens og maksimal fluorescens (Fv/Fm), maksimalt kvanteutbytte av PSII-fotokjemi (Fv/F0) og forholdet Fm/F0 beregnet (Baker, 2008, Lee et al. ). Relative klorofyll- og klorofyllfluorescensavlesninger ble tatt på de samme bladene som ble brukt til gs-målinger.
Omtrent 800 mg fersk bladvekt ble samlet inn som biokjemiske variabler. Bladprøver ble deretter homogenisert i flytende nitrogen og lagret for videre analyse. Den spektrometriske metoden som brukes for å estimere vevsklorofyll a, b og karotenoidinnhold er basert på metoden og ligningene beskrevet av Wellburn (1994). Bladvevsprøver (30 mg) ble samlet og homogenisert i 3 ml 80 % aceton. Prøvene ble deretter sentrifugert (modell 420101, Becton Dickinson Primary Care Diagnostics, USA) ved 5000 rpm i 10 minutter for å fjerne partikler. Supernatanten ble fortynnet til et sluttvolum på 6 ml ved å tilsette 80 % aceton (Sims og Gamon, 2002). Innholdet av klorofyll ble bestemt ved 663 (klorofyll a) og 646 (klorofyll b) nm, og karotenoider ved 470 nm ved bruk av et spektrofotometer (Spectronic BioMate 3 UV-vis, Thermo, USA).
Tiobarbitursyre (TBA)-metoden beskrevet av Hodges et al. (1999) ble brukt til å vurdere membranlipidperoksidasjon (MDA). Omtrent 0,3 g bladvev ble også homogenisert i flytende nitrogen. Prøvene ble sentrifugert ved 5000 rpm og absorbansen ble målt på et spektrofotometer ved 440, 532 og 600 nm. Til slutt ble MDA-konsentrasjonen beregnet ved å bruke ekstinksjonskoeffisienten (157 M mL−1).
Prolininnholdet i alle behandlinger ble bestemt ved å bruke metoden beskrevet av Bates et al. (1973). Tilsett 10 ml av en 3 % vandig løsning av sulfosalisylsyre til den lagrede prøven og filtrer gjennom Whatman-filterpapir (nr. 2). Deretter ble 2 ml av dette filtratet omsatt med 2 ml saltsyre og 2 ml iseddik. Blandingen ble plassert i et vannbad ved 90°C i 1 time. Stopp reaksjonen ved å inkubere på is. Rist røret kraftig med en vortex-rister og løs opp den resulterende løsningen i 4 ml toluen. Absorbansavlesninger ble bestemt ved 520 nm ved bruk av det samme spektrofotometeret som ble brukt for kvantifisering av fotosyntetiske pigmenter (Spectronic BioMate 3 UV-Vis, Thermo, Madison, WI, USA).
Metoden beskrevet av Gerhards et al. (2016) for å beregne kalesjetemperatur og CSI. Termiske fotografier ble tatt med et FLIR 2-kamera (FLIR Systems Inc., Boston, MA, USA) med en nøyaktighet på ±2°C ved slutten av stressperioden. Plasser en hvit overflate bak planten for fotografering. Igjen ble to fabrikker vurdert som referansemodeller. Plantene ble plassert på en hvit overflate; den ene ble belagt med en landbruksadjuvans (Agrotin, Bayer CropScience, Bogotá, Colombia) for å simulere åpningen av alle stomata [våt modus (Twet)], og den andre var et blad uten påføring [Dry mode (Tdry)] (Castro -Duque et al., 2020). Avstanden mellom kameraet og potten under filming var 1 m.
Den relative toleranseindeksen ble beregnet indirekte ved å bruke stomatal konduktans (gs) til behandlede planter sammenlignet med kontrollplanter (planter uten stressbehandlinger og med vekstregulatorer brukt) for å bestemme toleransen til de behandlede genotypene evaluert i denne studien. RTI ble oppnådd ved å bruke en ligning tilpasset fra Chávez-Arias et al. (2020).
I hvert eksperiment ble alle fysiologiske variabler nevnt ovenfor bestemt og registrert ved 55 DAE ved bruk av fullt utvidede blader samlet fra den øvre baldakinen. I tillegg ble det utført målinger i et vekstkammer for å unngå å endre miljøforholdene plantene vokser i.
Data fra det første og andre eksperimentet ble analysert sammen som en serie eksperimenter. Hver forsøksgruppe besto av 5 planter, og hver plante utgjorde en forsøksenhet. Variansanalyse (ANOVA) ble utført (P ≤ 0,05). Når signifikante forskjeller ble oppdaget, ble Tukeys post hoc komparative test brukt ved P ≤ 0,05. Bruk arcsine-funksjonen til å konvertere prosentverdier. Data ble analysert ved hjelp av Statistix v 9.0-programvare (Analytical Software, Tallahassee, FL, USA) og plottet ved bruk av SigmaPlot (versjon 10.0; Systat Software, San Jose, CA, USA). Hovedkomponentanalysen ble utført ved hjelp av InfoStat 2016-programvare (Analysis Software, National University of Cordoba, Argentina) for å identifisere de beste plantevekstregulatorene som studeres.
Tabell 1 oppsummerer ANOVA som viser eksperimentene, de forskjellige behandlingene og deres interaksjoner med bladfotosyntetiske pigmenter (klorofyll a, b, totalt og karotenoider), malondialdehyd (MDA) og prolininnhold, og stomatal konduktans. Effekt av gs, relativt vanninnhold. (RWC), klorofyllinnhold, klorofyll alfa-fluorescensparametere, kronetemperatur (PCT) (°C), avlingsstressindeks (CSI) og relativ toleranseindeks for risplanter ved 55 DAE.
Tabell 1. Sammendrag av ANOVA-data om risfysiologiske og biokjemiske variabler mellom eksperimenter (genotyper) og varmestressbehandlinger.
Forskjeller (P≤0,01) i bladfotosyntetiske pigmentinteraksjoner, relativt klorofyllinnhold (Aleaf-avlesninger) og alfa-klorofyllfluorescensparametere mellom eksperimenter og behandlinger er vist i tabell 2. Høye dag- og natttemperaturer økte totalt klorofyll- og karotenoidinnhold. Risfrøplanter uten bladspray av fytohormoner (2,36 mg g-1 for "F67" og 2,56 mg g-1 for "F2000") sammenlignet med planter dyrket under optimale temperaturforhold (2,67 mg g -1)) viste lavere totalt klorofyllinnhold. I begge eksperimentene var "F67" 2,80 mg g-1 og "F2000" var 2,80 mg g-1. I tillegg viste risfrøplanter behandlet med en kombinasjon av AUX- og GA-sprayer under varmestress også en reduksjon i klorofyllinnhold i begge genotyper (AUX = 1,96 mg g-1 og GA = 1,45 mg g-1 for "F67" ; AUX = 1,96 mg g-1 og GA = 7″ for 14 AUX. 2,24 mg) g-1 og GA = 1,43 mg g-1 (for “F2000″) under varmestressforhold. Under varmestressforhold resulterte bladbehandling med BR i en liten økning i denne variabelen i begge genotypene. Til slutt viste CK-bladspray de høyeste fotosyntetiske pigmentverdiene blant alle behandlinger (AUX, GA, BR, SC og AC-behandlinger) i genotypene F67 (3,24 mg g-1) og F2000 (3,65 mg g-1). Det relative innholdet av klorofyll (Atleaf-enhet) ble også redusert ved kombinert varmestress. De høyeste verdiene ble også registrert i planter sprøytet med CC i begge genotyper (41,66 for "F67" og 49,30 for "F2000"). Fv- og Fv/Fm-forhold viste signifikante forskjeller mellom behandlinger og kultivarer (tabell 2). Totalt sett, blant disse variablene, var kultivar F67 mindre utsatt for varmestress enn kultivar F2000. Fv- og Fv/Fm-forholdene led mer i det andre eksperimentet. Stressede 'F2000' frøplanter som ikke ble sprayet med noen fytohormoner hadde de laveste Fv-verdiene (2120,15) og Fv/Fm-forhold (0,59), men bladsprøyting med CK bidro til å gjenopprette disse verdiene (Fv: 2591, 89, Fv/Fm-forhold). , mottar avlesninger tilsvarende de som er registrert på "F2000"-planter dyrket under optimale temperaturforhold (Fv: 2955,35, Fv/Fm-forhold: 0,73:0,72). Det var ingen signifikante forskjeller i initial fluorescens (F0), maksimal fluorescens (Fm), maksimal fotokjemisk kvanteutbytte av PSII (Fv/F0) og Fm/F0-forhold. Til slutt viste BR en lignende trend som observert med CK (Fv 2545,06, Fv/Fm-forhold 0,73).
Tabell 2. Effekt av kombinert varmestress (40°/30°C dag/natt) på bladfotosyntetiske pigmenter [totalt klorofyll (Chl Total), klorofyll a (Chl a), klorofyll b (Chl b) og karotenoider Cx+c] effekt ], relative klorofyllinnhold (Atliff-enhet), maksimal klorofyllenhet (Fluor-fluorescens0), fluorescens (Fm), variabel fluorescens (Fv), maksimal PSII-effektivitet (Fv/Fm), fotokjemisk maksimal kvanteutbytte av PSII (Fv/F0 ) og Fm/F0 i planter av to risgenotyper [Federrose 67 (F67) og Federrose 2000 dager etter emning (F500000) (F5000000) (F250000)).
Relativt vanninnhold (RWC) av forskjellig behandlede risplanter viste forskjeller (P ≤ 0,05) i interaksjonen mellom eksperimentell og bladbehandling (Fig. 1A). Ved behandling med SA ble de laveste verdiene registrert for begge genotyper (74,01 % for F67 og 76,6 % for F2000). Under varmestressforhold økte RWC for risplanter av begge genotyper behandlet med forskjellige fytohormoner betydelig. Totalt sett økte bladapplikasjoner av CK, GA, AUX eller BR RWC til verdier som ligner de for planter dyrket under optimale forhold under eksperimentet. Absolutt kontroll og bladsprøytede planter registrerte verdier på rundt 83 % for begge genotyper. På den annen side viste gs også signifikante forskjeller (P ≤ 0,01) i interaksjonen mellom eksperiment og behandling (fig. 1B). Anlegget for absolutt kontroll (AC) registrerte også de høyeste verdiene for hver genotype (440,65 mmol m-2s-1 for F67 og 511,02 mmol m-2s-1 for F2000). Risplanter utsatt for kombinert varmestress alene viste de laveste gs-verdiene for begge genotypene (150,60 mmol m-2s-1 for F67 og 171,32 mmol m-2s-1 for F2000). Bladbehandling med alle plantevekstregulatorer økte også g. På F2000 risplanter sprøytet med CC var effekten av bladsprøyting med fytohormoner mer tydelig. Denne gruppen av planter viste ingen forskjeller sammenlignet med absolutte kontrollplanter (AC 511.02 og CC 499.25 mmol m-2s-1).
Figur 1. Effekt av kombinert varmestress (40°/30°C dag/natt) på relativt vanninnhold (RWC) (A), stomatal konduktans (gs) (B), malondialdehyd (MDA) produksjon (C) og prolininnhold. (D) i planter av to risgenotyper (F67 og F2000) 55 dager etter fremvekst (DAE). Behandlinger vurdert for hver genotype inkluderte: absolutt kontroll (AC), varmestresskontroll (SC), varmestress + auxin (AUX), varmestress + gibberellin (GA), varmestress + cellemitogen (CK) og varmestress + brassinosteroid. (BR). Hver kolonne representerer gjennomsnittet ± standardfeil for fem datapunkter (n = 5). Kolonner etterfulgt av forskjellige bokstaver indikerer statistisk signifikante forskjeller i henhold til Tukeys test (P ≤ 0,05). Bokstaver med likhetstegn indikerer at gjennomsnittet ikke er statistisk signifikant (≤ 0,05).
MDA (P ≤ 0,01) og prolin (P ≤ 0,01) innhold viste også signifikante forskjeller i interaksjonen mellom eksperiment og fytohormonbehandlinger (fig. 1C, D). Økt lipidperoksidasjon ble observert med SC-behandling i begge genotyper (Figur 1C), men planter behandlet med bladvekstregulatorspray viste redusert lipidperoksidasjon i begge genotyper; Generelt fører bruk av fytohormoner (CA, AUC, BR eller GA) til en reduksjon i lipidperoksidasjon (MDA-innhold). Det ble ikke funnet forskjeller mellom AC-planter av to genotyper og planter under varmestress og sprayet med fytohormoner (observerte FW-verdier i “F67”-planter varierte fra 4,38–6,77 µmol g-1, og i FW “F2000”-planter varierte “observerte verdier fra 2,181 til µmol på andre planter). hånd, var prolinsyntesen i "F67"-planter lavere enn i "F2000"-planter under kombinert stress, noe som førte til en økning i prolinproduksjonen i varmestressede risplanter, i begge eksperimentene ble det observert at administrering av disse hormonene økte aminosyreinnholdet i F2000-planter (AUX.44 og 30mol.44) betydelig. henholdsvis (fig. 1G).
Effektene av bladplantevekstregulatorspray og kombinert varmestress på plantekronens temperatur og relativ toleranseindeks (RTI) er vist i figur 2A og B. For begge genotypene var kronetemperaturen til AC-planter nær 27 °C, og den for SC-planter var rundt 28 °C. MED. Det ble også observert at bladbehandlinger med CK og BR resulterte i en 2–3 °C reduksjon i baldakintemperatur sammenlignet med SC-planter (Figur 2A). RTI viste lignende oppførsel som andre fysiologiske variabler, og viste signifikante forskjeller (P ≤ 0,01) i interaksjonen mellom eksperiment og behandling (figur 2B). SC-planter viste lavere plantetoleranse i begge genotyper (34,18% og 33,52% for henholdsvis "F67" og "F2000" risplanter). Bladfôring av fytohormoner forbedrer RTI i planter utsatt for høytemperaturstress. Denne effekten var mer uttalt i "F2000" planter sprayet med CC, der RTI var 97,69. På den annen side ble det kun observert signifikante forskjeller i avlingsstressindeksen (CSI) for risplanter under spraystressforhold for bladfaktor (P ≤ 0,01) (fig. 2B). Bare risplanter utsatt for kompleks varmestress viste den høyeste stressindeksverdien (0,816). Når risplanter ble sprayet med ulike fytohormoner, var stressindeksen lavere (verdier fra 0,6 til 0,67). Til slutt hadde risplanten dyrket under optimale forhold en verdi på 0,138.
Figur 2. Effekter av kombinert varmestress (40°/30°C dag/natt) på kronetemperatur (A), relativ toleranseindeks (RTI) (B), og avlingsstressindeks (CSI) (C) for to plantearter. Kommersielle risgenotyper (F67 og F2000) ble utsatt for forskjellige varmebehandlinger. Behandlinger vurdert for hver genotype inkluderte: absolutt kontroll (AC), varmestresskontroll (SC), varmestress + auxin (AUX), varmestress + gibberellin (GA), varmestress + cellemitogen (CK) og varmestress + brassinosteroid. (BR). Kombinert varmestress innebærer å utsette risplanter for høye dag/natt-temperaturer (40°/30°C dag/natt). Hver kolonne representerer gjennomsnittet ± standardfeil for fem datapunkter (n = 5). Kolonner etterfulgt av forskjellige bokstaver indikerer statistisk signifikante forskjeller i henhold til Tukeys test (P ≤ 0,05). Bokstaver med likhetstegn indikerer at gjennomsnittet ikke er statistisk signifikant (≤ 0,05).
Hovedkomponentanalyse (PCA) viste at variablene vurdert ved 55 DAE forklarte 66,1 % av de fysiologiske og biokjemiske responsene til varmestressede risplanter behandlet med vekstregulatorspray (fig. 3). Vektorer representerer variabler og prikker representerer plantevekstregulatorer (GR). Vektorene av gs, klorofyllinnhold, maksimal kvanteeffektivitet av PSII (Fv/Fm) og biokjemiske parametere (TChl, MDA og prolin) er i nære vinkler til opprinnelsen, noe som indikerer en høy korrelasjon mellom den fysiologiske oppførselen til planter og dem. variabel. En gruppe (V) inkluderte risfrøplanter dyrket ved optimal temperatur (AT) og F2000-planter behandlet med CK og BA. Samtidig dannet flertallet av plantene behandlet med GR en egen gruppe (IV), og behandling med GA i F2000 dannet en egen gruppe (II). I motsetning til dette ble varmestressede risfrøplanter (gruppe I og III) uten bladspray av fytohormoner (begge genotyper var SC) lokalisert i en sone motsatt gruppe V, noe som demonstrerte effekten av varmestress på plantefysiologien. .
Figur 3. Bigrafisk analyse av effektene av kombinert varmestress (40°/30°C dag/natt) på planter av to risgenotyper (F67 og F2000) 55 dager etter fremvekst (DAE). Forkortelser: AC F67, absolutt kontroll F67; SC F67, varmestresskontroll F67; AUX F67, varmestress + auxin F67; GA F67, varmestress + gibberellin F67; CK F67, varmestress + celledeling BR F67, varmestress + brassinosteroid. F67; AC F2000, absolutt kontroll F2000; SC F2000, Heat Stress Control F2000; AUX F2000, varmestress + auxin F2000; GA F2000, varmestress + gibberellin F2000; CK F2000, varmestress + cytokinin, BR F2000, varmestress + messingsteroid; F2000.
Variabler som klorofyllinnhold, stomatal konduktans, Fv/Fm-forhold, CSI, MDA, RTI og prolininnhold kan hjelpe til med å forstå tilpasningen av risgenotyper og evaluere virkningen av agronomiske strategier under varmestress (Sarsu et al., 2018; Quintero-Calderon et al., 2021). Formålet med dette eksperimentet var å evaluere effekten av bruk av fire vekstregulatorer på de fysiologiske og biokjemiske parametrene til risfrøplanter under komplekse varmestressforhold. Frøplantetesting er en enkel og rask metode for samtidig vurdering av risplanter avhengig av størrelse eller tilstand på tilgjengelig infrastruktur (Sarsu et al. 2018). Resultatene av denne studien viste at kombinert varmestress induserer forskjellige fysiologiske og biokjemiske responser i de to risgenotypene, noe som indikerer en tilpasningsprosess. Disse resultatene indikerer også at bladvekstregulatorsprayer (hovedsakelig cytokininer og brassinosteroider) hjelper ris med å tilpasse seg komplekst varmestress, da fordel hovedsakelig påvirker gs, RWC, Fv/Fm-forhold, fotosyntetiske pigmenter og prolininnhold.
Anvendelse av vekstregulatorer bidrar til å forbedre vannstatusen til risplanter under varmestress, noe som kan være assosiert med høyere stress og lavere plantekronetemperaturer. Denne studien viste at blant "F2000" (mottakelig genotype) planter hadde risplanter behandlet primært med CK eller BR høyere gs-verdier og lavere PCT-verdier enn planter behandlet med SC. Tidligere studier har også vist at gs og PCT er nøyaktige fysiologiske indikatorer som kan bestemme den adaptive responsen til risplanter og effekten av agronomiske strategier på varmestress (Restrepo-Diaz og Garces-Varon, 2013; Sarsu et al., 2018; Quintero). -Carr DeLong et al., 2021). Blad CK eller BR øker g under stress fordi disse plantehormonene kan fremme stomatal åpning gjennom syntetiske interaksjoner med andre signalmolekyler som ABA (promoter av stomatal lukking under abiotisk stress) (Macková et al., 2013; Zhou et al., 2013). 2013). ). , 2014). Stomatal åpning fremmer bladkjøling og bidrar til å redusere baldakintemperaturer (Sonjaroon et al., 2018; Quintero-Calderón et al., 2021). Av disse grunnene kan baldakintemperaturen til risplanter sprayet med CK eller BR være lavere under kombinert varmestress.
Høy temperaturstress kan redusere det fotosyntetiske pigmentinnholdet i blader (Chen et al., 2017; Ahammed et al., 2018). I denne studien, når risplanter var under varmestress og ikke sprayet med noen plantevekstregulatorer, hadde fotosyntetiske pigmenter en tendens til å avta i begge genotyper (tabell 2). Feng et al. (2013) rapporterte også en betydelig nedgang i klorofyllinnhold i blader av to hvete-genotyper utsatt for varmestress. Eksponering for høye temperaturer resulterer ofte i redusert klorofyllinnhold, noe som kan skyldes redusert klorofyllbiosyntese, nedbrytning av pigmenter eller deres kombinerte effekter under varmestress (Fahad et al., 2017). Imidlertid økte risplanter behandlet hovedsakelig med CK og BA konsentrasjonen av bladfotosyntetiske pigmenter under varmestress. Lignende resultater ble også rapportert av Jespersen og Huang (2015) og Suchsagunpanit et al. (2015), som observerte en økning i bladklorofyllinnhold etter påføring av zeatin og epibrassinosteroidhormoner i henholdsvis varmestresset bentgress og ris. En rimelig forklaring på hvorfor CK og BR fremmer økt bladklorofyllinnhold under kombinert varmestress er at CK kan forsterke initieringen av vedvarende induksjon av ekspresjonspromotere (som den senescensaktiverende promoteren (SAG12) eller HSP18 promoteren) og redusere klorofylltapet i blader. , forsinker bladens alderdom og øker plantens motstand mot varme (Liu et al., 2020). BR kan beskytte bladklorofyll og øke bladklorofyllinnhold ved å aktivere eller indusere syntesen av enzymer involvert i klorofyllbiosyntese under stressforhold (Sharma et al., 2017; Siddiqui et al., 2018). Til slutt fremmer to fytohormoner (CK og BR) også uttrykket av varmesjokkproteiner og forbedrer ulike metabolske tilpasningsprosesser, for eksempel økt klorofyllbiosyntese (Sharma et al., 2017; Liu et al., 2020).
Klorofyll a-fluorescensparametere gir en rask og ikke-destruktiv metode som kan vurdere plantetoleranse eller tilpasning til abiotiske stressforhold (Chaerle et al. 2007; Kalaji et al. 2017). Parametere som Fv/Fm-forholdet har blitt brukt som indikatorer på plantens tilpasning til stressforhold (Alvarado-Sanabria et al. 2017; Chavez-Arias et al. 2020). I denne studien viste SC-planter de laveste verdiene av denne variabelen, hovedsakelig "F2000" risplanter. Yin et al. (2010) fant også at Fv/Fm-forholdet for risbladene med høyest roterende avgang sank betydelig ved temperaturer over 35°C. I følge Feng et al. (2013), indikerer det lavere Fv/Fm-forholdet under varmestress at hastigheten på eksitasjonsenergifangst og -konvertering av PSII-reaksjonssenteret er redusert, noe som indikerer at PSII-reaksjonssenteret går i oppløsning under varmestress. Denne observasjonen lar oss konkludere med at forstyrrelser i det fotosyntetiske apparatet er mer uttalt i sensitive varianter (Fedearroz 2000) enn i resistente varianter (Fedearroz 67).
Bruken av CK eller BR forbedret generelt ytelsen til PSII under komplekse varmestressforhold. Lignende resultater ble oppnådd av Suchsagunpanit et al. (2015), som observerte at BR-applikasjon økte effektiviteten til PSII under varmestress i ris. Kumar et al. (2020) fant også at kikertplanter behandlet med CK (6-benzyladenin) og utsatt for varmestress økte Fv/Fm-forholdet, og konkluderte med at bladpåføring av CK ved å aktivere zeaxanthin-pigmentsyklusen fremmet PSII-aktivitet. I tillegg favoriserte BR-bladspray PSII-fotosyntese under kombinerte stressforhold, noe som indikerer at bruk av dette fytohormonet resulterte i redusert spredning av eksitasjonsenergien til PSII-antenner og fremmet akkumulering av små varmesjokkproteiner i kloroplaster (Ogweno et al. 2008; Kothari og Lachowitz ). , 2021).
MDA- og prolininnhold øker ofte når planter er under abiotisk stress sammenlignet med planter dyrket under optimale forhold (Alvarado-Sanabria et al. 2017). Tidligere studier har også vist at MDA- og prolinnivåer er biokjemiske indikatorer som kan brukes til å forstå tilpasningsprosessen eller virkningen av agronomiske praksiser i ris under høye temperaturer på dagtid eller natt (Alvarado-Sanabria et al., 2017; Quintero-Calderón et al. . , 2021). Disse studiene viste også at MDA- og prolininnholdet hadde en tendens til å være høyere i risplanter som ble utsatt for høye temperaturer henholdsvis om natten eller om dagen. Imidlertid bidro bladsprøyting av CK og BR til en reduksjon i MDA og en økning i prolinnivåer, hovedsakelig i den tolerante genotypen (Federroz 67). CK-spray kan fremme overekspresjon av cytokininoksidase/dehydrogenase, og dermed øke innholdet av beskyttende forbindelser som betain og prolin (Liu et al., 2020). BR fremmer induksjonen av osmoprotektanter som betain, sukker og aminosyrer (inkludert fritt prolin), og opprettholder cellulær osmotisk balanse under mange ugunstige miljøforhold (Kothari og Lachowiec, 2021).
Avlingsstressindeks (CSI) og relativ toleranseindeks (RTI) brukes for å bestemme om behandlingene som evalueres bidrar til å dempe ulike påkjenninger (abiotiske og biotiske) og har en positiv effekt på plantefysiologien (Castro-Duque et al., 2020; Chavez-Arias et al., 2020). CSI-verdier kan variere fra 0 til 1, som representerer henholdsvis ikke-stress- og stresstilstander (Lee et al., 2010). CSI-verdiene for varmestressede (SC) planter varierte fra 0,8 til 0,9 (Figur 2B), noe som indikerer at risplanter ble negativt påvirket av kombinert stress. Imidlertid førte bladsprøyting av BC (0,6) eller CK (0,6) hovedsakelig til en reduksjon i denne indikatoren under abiotiske stressforhold sammenlignet med SC-risplanter. I F2000-planter viste RTI en høyere økning ved bruk av CA (97,69%) og BC (60,73%) sammenlignet med SA (33,52%), noe som indikerer at disse plantevekstregulatorene også bidrar til å forbedre responsen til ris på toleransen til sammensetningen. Overoppheting. Disse indeksene har blitt foreslått for å håndtere stressforhold i forskjellige arter. En studie utført av Lee et al. (2010) viste at CSI for to bomullsvarianter under moderat vannbelastning var omtrent 0,85, mens CSI-verdiene for godt vannete varianter varierte fra 0,4 til 0,6, og konkluderte med at denne indeksen er en indikator på vanntilpasningen til variantene. stressende forhold. Dessuten har Chavez-Arias et al. (2020) vurderte effektiviteten til syntetiske elicitorer som en omfattende stresshåndteringsstrategi i C. elegans-planter og fant at planter sprayet med disse forbindelsene viste høyere RTI (65 %). Basert på ovenstående kan CK og BR betraktes som agronomiske strategier som tar sikte på å øke toleransen til ris for komplekst varmestress, da disse plantevekstregulatorene induserer positive biokjemiske og fysiologiske responser.
I løpet av de siste årene har risforskning i Colombia fokusert på å evaluere genotyper som er tolerante for høye dag- eller natttemperaturer ved å bruke fysiologiske eller biokjemiske egenskaper (Sánchez-Reinoso et al., 2014; Alvarado-Sanabria et al., 2021). Men i de siste årene har analysen av praktiske, økonomiske og lønnsomme teknologier blitt stadig viktigere for å foreslå integrert avlingsforvaltning for å forbedre effekten av komplekse perioder med varmestress i landet (Calderón-Páez et al., 2021; Quintero-Calderon et al., 2021). De fysiologiske og biokjemiske responsene til risplanter på komplekst varmestress (40 °C dag/30 °C natt) observert i denne studien antyder således at bladsprøyting med CK eller BR kan være en egnet avlingsforvaltningsmetode for å dempe uønskede effekter. Effekt av perioder med moderat varmestress. Disse behandlingene forbedret toleransen til begge risgenotypene (lav CSI og høy RTI), og demonstrerte en generell trend i plantefysiologiske og biokjemiske responser under kombinert varmestress. Hovedresponsen til risplanter var en reduksjon i innholdet av GC, totalt klorofyll, klorofyll α og β og karotenoider. I tillegg lider planter av PSII-skader (reduserte klorofyllfluorescensparametere som Fv/Fm-forhold) og økt lipidperoksidasjon. På den annen side, når ris ble behandlet med CK og BR, ble disse negative effektene dempet og prolininnholdet økte (fig. 4).
Figur 4. Konseptuell modell av effektene av kombinert varmestress og bladplantevekstregulatorspray på risplanter. Røde og blå piler indikerer de negative eller positive effektene av interaksjonen mellom varmestress og bladpåføring av BR (brassinosteroid) og CK (cytokinin) på henholdsvis fysiologiske og biokjemiske responser. gs: stomatal konduktans; Total Chl: totalt klorofyllinnhold; Chl α: klorofyll β innhold; Cx+c: karotenoidinnhold;
Oppsummert indikerer de fysiologiske og biokjemiske responsene i denne studien at Fedearroz 2000 risplanter er mer utsatt for en periode med kompleks varmestress enn Fedearroz 67 risplanter. Alle vekstregulatorer vurdert i denne studien (auxiner, gibberelliner, cytokininer eller brassinosteroider) viste en viss grad av kombinert varmestressreduksjon. Imidlertid induserte cytokinin og brassinosteroider bedre plantetilpasning ettersom begge plantevekstregulatorene økte klorofyllinnholdet, alfa-klorofyllfluorescensparametrene, gs og RWC sammenlignet med risplanter uten bruk, og også reduserte MDA-innhold og baldakintemperatur. Oppsummert konkluderer vi med at bruk av plantevekstregulatorer (cytokininer og brassinosteroider) er et nyttig verktøy for å håndtere stressforhold i risavlinger forårsaket av alvorlig varmestress i perioder med høye temperaturer.
Det originale materialet presentert i studien er inkludert i artikkelen, og ytterligere henvendelser kan rettes til den tilsvarende forfatteren.