Shoot apical meristem (SAM) vekst er avgjørende for stilkarkitektur. Plantehormonergibberelliner(GA-er) spiller nøkkelroller i å koordinere plantevekst, men deres rolle i SAM er fortsatt dårlig forstått. Her utviklet vi en ratiometrisk biosensor for GA-signalering ved å konstruere DELLA-proteinet for å undertrykke dets essensielle regulatoriske funksjon i GA-transkripsjonsresponsen samtidig som de bevarer dens nedbrytning ved GA-gjenkjenning. Vi demonstrerer at denne nedbrytningsbaserte biosensoren nøyaktig registrerer endringer i GA-nivåer og cellulær sensing under utvikling. Vi brukte denne biosensoren til å kartlegge GA-signaleringsaktivitet i SAM. Vi viser at høye GA-signaler er tilstede hovedsakelig i celler som ligger mellom organprimordia, som er forløpere til internodeceller. Ved å bruke gevinst- og tap-av-funksjon-tilnærminger demonstrerer vi videre at GA regulerer orienteringen til celledelingsplanet, etablerer den kanoniske cellulære organisasjonen til internoder, og fremmer derved internodespesifikasjon i SAM.
Shoot apical meristem (SAM), som ligger ved skuddspissen, inneholder en nisje av stamceller hvis aktivitet genererer laterale organer og stilknoder på en modulær og iterativ måte gjennom hele plantens levetid. Hver av disse repeterende enhetene, eller plantenodene, inkluderer internoder og laterale organer ved nodene, og aksillære meristemer i bladakslene1. Veksten og organiseringen av plantenoder endres under utviklingen. I Arabidopsis undertrykkes internodal vekst i det vegetative stadiet, og aksillære meristemer forblir sovende i akslene til rosettblader. Under overgangen til blomsterfasen blir SAM til blomsterstandens meristem, og genererer langstrakte internoder og aksillære knopper, grener i akslene på caulineblader og senere bladløse blomster2. Selv om vi har gjort betydelige fremskritt med å forstå mekanismene som kontrollerer initieringen av blader, blomster og grener, er relativt lite kjent om hvordan internoder oppstår.
Å forstå den spatiotemporale fordelingen av GA-er vil bidra til bedre å forstå funksjonene til disse hormonene i forskjellige vev og på forskjellige utviklingsstadier. Visualisering av nedbrytningen av RGA-GFP-fusjon uttrykt under påvirkning av sin egen promoter gir viktig informasjon om reguleringen av totale GA-nivåer i røtter15,16. Imidlertid varierer RGA-uttrykk på tvers av vev17 og reguleres av GA18. Dermed kan differensiell ekspresjon av RGA-promotoren resultere i fluorescensmønsteret observert med RGA-GFP, og derfor er denne metoden ikke kvantitativ. Mer nylig avslørte bioaktivt fluorescein (Fl)-merket GA19,20 akkumulering av GA i rotendokortex og reguleringen av cellenivåene ved GA-transport. Nylig viste GA FRET-sensoren nlsGPS1 at GA-nivåer korrelerer med celleforlengelse i røtter, filamenter og mørkvokste hypokotyler21. Men, som vi har sett, er GA-konsentrasjon ikke den eneste parameteren som kontrollerer GA-signaleringsaktivitet, da den avhenger av komplekse sensingsprosesser. Her, basert på vår forståelse av DELLA- og GA-signalveiene, rapporterer vi utviklingen og karakteriseringen av en degraderingsbasert ratiometrisk biosensor for GA-signalering. For å utvikle denne kvantitative biosensoren brukte vi en mutant GA-sensitiv RGA som ble smeltet sammen til et fluorescerende protein og allestedsnærværende uttrykt i vev, samt et GA-ufølsomt fluorescerende protein. Vi viser at de mutante RGA-proteinfusjonene ikke forstyrrer endogen GA-signalering når de uttrykkes allestedsnærværende, og at denne biosensoren kan kvantifisere signalaktivitet som følge av både GA-inngang og GA-signalbehandling av sanseapparatet med høy spatiotemporal oppløsning. Vi brukte denne biosensoren for å kartlegge den spatiotemporale fordelingen av GA-signalaktivitet og kvantifisere hvordan GA regulerer cellulær oppførsel i SAM-epidermis. Vi demonstrerer at GA regulerer orienteringen av delingsplanet til SAM-celler som ligger mellom organprimordia, og definerer derved den kanoniske cellulære organisasjonen til internoden.
Til slutt spurte vi om qmRGA kunne rapportere endringer i endogene GA-nivåer ved å bruke voksende hypokotyler. Vi har tidligere vist at nitrat stimulerer vekst ved å øke GA-syntese og, i sin tur, DELLA34-nedbrytning. Følgelig observerte vi at hypokotyllengden i pUBQ10::qmRGA frøplanter dyrket under rikelig nitrattilførsel (10 mM NO3-) var betydelig lengre enn i frøplanter dyrket under nitratmangelforhold (tilleggsfigur 6a). I samsvar med vekstresponsen var GA-signaler høyere i hypokotyler fra frøplanter dyrket under 10 mM NO3−forhold enn i frøplanter dyrket i fravær av nitrat (tilleggsfigur 6b, c). Dermed muliggjør qmRGA også overvåking av endringer i GA-signalering indusert av endogene endringer i GA-konsentrasjon.
For å forstå om GA-signalaktiviteten oppdaget av qmRGA avhenger av GA-konsentrasjon og GA-oppfatning, som forventet basert på sensordesignet, analyserte vi uttrykket av de tre GID1-reseptorene i vegetativt og reproduktivt vev. I frøplanter viste GID1-GUS-reporterlinjen at GID1a og c var sterkt uttrykt i cotyledoner (fig. 3a–c). I tillegg ble alle tre reseptorene uttrykt i blader, lateral rot primordia, rotspisser (bortsett fra rothetten til GID1b) og det vaskulære systemet (fig. 3a–c). I blomsterstanden SAM oppdaget vi GUS-signaler kun for GID1b og 1c (Supplerende Fig. 7a–c). Hybridisering in situ bekreftet disse ekspresjonsmønstrene og demonstrerte videre at GID1c ble jevnt uttrykt ved lave nivåer i SAM, mens GID1b viste høyere ekspresjon i periferien av SAM (tilleggsfig. 7d–l). Translasjonsfusjonen pGID1b::2xmTQ2-GID1b avslørte også et gradert utvalg av GID1b-ekspresjon, fra lavt eller ingen uttrykk i sentrum av SAM til høy ekspresjon ved organgrensene (tilleggsfig. 7m). Dermed er GID1-reseptorer ikke jevnt fordelt over og i vev. I påfølgende eksperimenter observerte vi også at overekspresjon av GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) økte følsomheten til qmRGA i hypokotyler for ekstern GA-påføring (fig. 3d, e). I motsetning til dette var fluorescens målt med qd17mRGA i hypokotylen ufølsom for GA3-behandling (fig. 3f, g). For begge analysene ble frøplanter behandlet med høye konsentrasjoner av GA (100 μM GA3) for å vurdere den raske oppførselen til sensoren, hvor evnen til å binde seg til GID1-reseptoren ble forbedret eller tapt. Sammen bekrefter disse resultatene at qmRGA-biosensoren tjener en kombinert funksjon som en GA- og GA-sensor, og antyder at differensiell ekspresjon av GID1-reseptoren kan modulere emissiviteten til sensoren betydelig.
Til dags dato er distribusjonen av GA-signaler i SAM fortsatt uklar. Derfor brukte vi qmRGA-uttrykkende planter og pCLV3::mCherry-NLS stamcelle-reporter35 for å beregne høyoppløselige kvantitative kart over GA-signalaktivitet, med fokus på L1-laget (epidermis; Fig. 4a, b, se Metoder og supplerende metoder), siden L1 spiller en nøkkelrolle i vekst36. Her ga pCLV3 :: mCherry-NLS uttrykk et fast geometrisk referansepunkt for å analysere den spatiotemporale fordelingen av GA-signalaktivitet37. Selv om GA anses som essensielt for laterale organutvikling4, observerte vi at GA-signalene var lave i floral primordium (P) fra og med P3-stadiet (fig. 4a, b), mens unge P1 og P2 primordiums hadde moderat aktivitet lik den i den sentrale regionen (fig. 4a, b). Høyere GA-signaleringsaktivitet ble påvist ved organets primordium-grenser, med start ved P1/P2 (ved sidene av grensen) og toppet ved P4, samt i alle celler i den perifere regionen lokalisert mellom primordia (fig. 4a, b og tilleggsfig. 8a, b). Denne høyere GA-signalaktiviteten ble observert ikke bare i epidermis, men også i L2- og øvre L3-lag (tilleggsfigur 8b). Mønsteret av GA-signaler oppdaget i SAM ved bruk av qmRGA forble også uendret over tid (tilleggsfigur 8c–f, k). Selv om qd17mRGA-konstruksjonen ble systematisk nedregulert i SAM av T3-planter fra fem uavhengige linjer som vi karakteriserte i detalj, var vi i stand til å analysere fluorescensmønstrene oppnådd med pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP-konstruksjonen (tilleggsfigur 8g–j, l). I denne kontrolllinjen ble det kun påvist mindre endringer i fluorescensforholdet i SAM, men i SAM-senteret observerte vi en klar og uventet reduksjon i VENUS assosiert med TagBFP. Dette bekrefter at signalmønsteret observert av qmRGA reflekterer GA-avhengig nedbrytning av mRGA-VENUS, men viser også at qmRGA kan overvurdere GA-signaleringsaktivitet i meristemsenteret. Oppsummert avslører resultatene våre et GA-signalmønster som først og fremst gjenspeiler fordelingen av primordia. Denne fordelingen av den interprimordiale regionen (IPR) skyldes gradvis etablering av høy GA-signalaktivitet mellom det utviklende primordiumet og det sentrale området, samtidig som GA-signaleringsaktiviteten i primordium avtar (fig. 4c, d).
Fordelingen av GID1b- og GID1c-reseptorer (se ovenfor) antyder at differensiell ekspresjon av GA-reseptorer bidrar til å forme mønsteret av GA-signalaktivitet i SAM. Vi lurte på om differensiell akkumulering av GA kan være involvert. For å undersøke denne muligheten brukte vi nlsGPS1 GA FRET sensor21. Økt aktiveringsfrekvens ble oppdaget i SAM av nlsGPS1 behandlet med 10 μM GA4+7 i 100 minutter (Supplerende Fig. 9a–e), noe som indikerer at nlsGPS1 reagerer på endringer i GA-konsentrasjon i SAM, slik det gjør i roots21. Romlig fordeling av nlsGPS1-aktiveringsfrekvens avslørte relativt lave GA-nivåer i de ytre lagene av SAM, men viste at de var forhøyet i sentrum og ved grensene til SAM (fig. 4e og tilleggsfig. 9a,c). Dette antyder at GA også er distribuert i SAM med et romlig mønster som kan sammenlignes med det avslørt av qmRGA. Som en komplementær tilnærming behandlet vi også SAM med fluorescerende GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) eller Fl alene som en negativ kontroll. Fl-signalet ble distribuert over hele SAM, inkludert den sentrale regionen og primordium, om enn med en lavere intensitet (fig. 4j og tilleggsfig. 10d). I kontrast akkumulerte alle tre GA-Fl spesifikt innenfor primordium-grensene og i varierende grad i resten av IPR, med GA7-Fl som akkumulerte i det største domenet i IPR (fig. 4k og tilleggsfig. 10a,b). Kvantifisering av fluorescensintensitet avslørte at IPR til ikke-IPR-intensitetsforholdet var høyere i GA-Fl-behandlet SAM sammenlignet med Fl-behandlet SAM (fig. 4l og tilleggsfig. 10c). Sammen antyder disse resultatene at GA er tilstede i høyere konsentrasjoner i IPR-celler som er plassert nærmest organgrensen. Dette antyder at mønsteret av SAM GA-signaleringsaktivitet er resultatet av både differensiell ekspresjon av GA-reseptorer og differensiell akkumulering av GA i IPR-celler nær organgrenser. Dermed avslørte vår analyse et uventet spatiotemporalt mønster av GA-signalering, med lavere aktivitet i sentrum og primordium av SAM og høyere aktivitet i IPR i den perifere regionen.
For å forstå rollen til differensiell GA-signaleringsaktivitet i SAM, analyserte vi korrelasjonen mellom GA-signaleringsaktivitet, celleutvidelse og celledeling ved å bruke sanntids time-lapse-avbildning av SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Gitt rollen til GA i vekstregulering, var en positiv korrelasjon med celleekspansjonsparametere forventet. Derfor sammenlignet vi først GA-signalaktivitetskart med kart over celleoverflateveksthastighet (som en proxy for styrken av celleekspansjon for en gitt celle og for datterceller ved deling) og med kart over vekstanisotropi, som måler retningsbestemt celleekspansjon (også brukt her for en gitt celle og for datterceller ved deling; Fig. 5a,b, se Metoder og supplerende metoder). Våre kart over SAM-celleoverflateveksthastighet er i samsvar med tidligere observasjoner38,39, med minimale vekstrater ved grensen og maksimale vekstrater i utviklende blomster (fig. 5a). Hovedkomponentanalyse (PCA) viste at GA-signalaktivitet var negativt korrelert med celleoverflatevekstintensitet (figur 5c). Vi viste også at hovedaksene for variasjon, inkludert GA-signalinngang og vekstintensitet, var ortogonale til retningen bestemt av høy CLV3-ekspresjon, noe som bekrefter ekskluderingen av celler fra SAM-senteret i de gjenværende analysene. Spearman-korrelasjonsanalyse bekreftet PCA-resultatene (Figur 5d), noe som indikerer at høyere GA-signaler i IPR ikke resulterte i høyere celleekspansjon. Korrelasjonsanalyse avslørte imidlertid en svak positiv korrelasjon mellom GA-signaleringsaktivitet og vekstanisotropi (figur 5c, d), noe som tyder på at høyere GA-signalering i IPR påvirker cellevekstretningen og muligens posisjonen til celledelingsplanet.
a, b Varmekart av gjennomsnittlig overflatevekst (a) og vekstanisotropi (b) i SAM var gjennomsnittlig over syv uavhengige planter (brukt som proxyer for henholdsvis styrken og retningen av celleekspansjon). c PCA-analyse inkluderte følgende variabler: GA-signal, overflatevekstintensitet, overflatevekstanisotropi og CLV3-ekspresjon. PCA-komponent 1 var hovedsakelig negativt korrelert med overflatevekstintensitet og positivt korrelert med GA-signal. PCA-komponent 2 var hovedsakelig positivt korrelert med overflatevekstanisotropi og negativt korrelert med CLV3-ekspresjon. Prosentandeler representerer variasjonen som forklares av hver komponent. d Spearman-korrelasjonsanalyse mellom GA-signal, overflatevekstintensitet og overflatevekstanisotropi i vevsskalaen unntatt CZ. Tallet til høyre er Spearman rho-verdien mellom to variabler. Stjerner indikerer tilfeller der korrelasjonen/negative korrelasjonen er svært signifikant. e 3D-visualisering av Col-0 SAM L1-celler ved konfokalmikroskopi. Nye cellevegger dannet i SAM (men ikke primordium) etter 10 timer er farget i henhold til deres vinkelverdier. Fargelinjen vises i nedre høyre hjørne. Innsatsen viser det tilsvarende 3D-bildet ved 0 timer. Eksperimentet ble gjentatt to ganger med lignende resultater. f Boksplott viser celledelingshastigheter i IPR og ikke-IPR Col-0 SAM (n = 10 uavhengige planter). Midtlinjen viser medianen, og boksgrensene indikerer 25. og 75. persentil. Whiskers indikerer minimums- og maksimumsverdiene som er bestemt med R-programvare. P-verdier ble oppnådd med Welchs to-halede t-test. g, h Skjematisk diagram som viser (g) hvordan man måler vinkelen til den nye celleveggen (magenta) i forhold til den radielle retningen fra sentrum av SAM (hvit stiplet linje) (bare spisse vinkelverdier, dvs. 0–90°, tas i betraktning), og (h) de periferiske/laterale og radielle retningene innenfor meristem. i Frekvenshistogrammer for celledelingsplanorientering over henholdsvis SAM (mørk blå), IPR (middels blå) og ikke-IPR (lyseblå). P-verdier ble oppnådd ved en to-halet Kolmogorov-Smirnov-test. Eksperimentet ble gjentatt to ganger med lignende resultater. j Frekvenshistogrammer for celledelingsplanorientering av IPR rundt henholdsvis P3 (lysegrønn), P4 (middelsgrønn) og P5 (mørkegrønn). P-verdier ble oppnådd ved en to-halet Kolmogorov-Smirnov-test. Eksperimentet ble gjentatt to ganger med lignende resultater.
Derfor undersøkte vi deretter korrelasjonen mellom GA-signalering og celledelingsaktivitet ved å identifisere nydannede cellevegger under analysen (fig. 5e). Denne tilnærmingen tillot oss å måle frekvensen og retningen av celledeling. Overraskende nok fant vi at frekvensen av celledelinger i IPR og resten av SAM (ikke-IPR, fig. 5f) var lik, noe som indikerer at forskjeller i GA-signalering mellom IPR- og ikke-IPR-celler ikke påvirker celledelingen signifikant. Dette, og den positive korrelasjonen mellom GA-signalering og vekstanisotropi, fikk oss til å vurdere om GA-signaleringsaktivitet kunne påvirke orienteringen til celledelingsplanet. Vi målte orienteringen til den nye celleveggen som en spiss vinkel i forhold til den radielle aksen som forbinder meristemsenteret og senteret av den nye celleveggen (fig. 5e-i) og observerte en klar tendens for celler til å dele seg i vinkler nær 90° i forhold til den radielle aksen, med de høyeste frekvensene observert ved 8.090.000 – 8.000. (22,62%) (fig. 5e,i), tilsvarende celledelinger i omkrets/tverrretning (fig. 5h). For å undersøke bidraget til GA-signalering til denne celledelingsatferden, analyserte vi celledelingsparametere i IPR og ikke-IPR separat (fig. 5i). Vi observerte at delingsvinkelfordelingen i IPR-celler skilte seg fra den i ikke-IPR-celler eller i celler i hele SAM, med IPR-celler som viste en høyere andel laterale/sirkulære celledelinger, dvs. 70–80° og 80–90° (henholdsvis 33,86% og 30,71% proporsjoner 5, Fig.i). Dermed avslørte våre observasjoner en assosiasjon mellom høy GA-signalering og en celledelingsplanorientering nær periferretningen, lik korrelasjonen mellom GA-signaleringsaktivitet og vekstanisotropi (fig. 5c, d). For ytterligere å etablere den romlige bevaringen av denne assosiasjonen, målte vi delingsplanorienteringen i IPR-celler som omgir primordiumet fra P3, siden den høyeste GA-signaleringsaktiviteten ble oppdaget i denne regionen fra P4 (fig. 4). Delingsvinklene til IPR rundt P3 og P4 viste ingen statistisk signifikante forskjeller, selv om en økt frekvens av laterale celledelinger ble observert i IPR rundt P4 (fig. 5j). I IPR-cellene rundt P5 ble imidlertid forskjellen i orienteringen til celledelingsplanet statistisk signifikant, med en kraftig økning i frekvensen av tverrgående celledelinger (fig. 5j). Sammen antyder disse resultatene at GA-signalering kan kontrollere orienteringen av celledelinger i SAM, som er i samsvar med tidligere rapporter40,41 om at høy GA-signalering kan indusere lateral orientering av celledelinger i IPR.
Det er spådd at celler i IPR ikke vil bli inkorporert i primordia, men heller i internoder2,42,43. Den tverrgående orienteringen av celledelinger i IPR kan resultere i den typiske organiseringen av parallelle langsgående rader av epidermale celler i internoder. Våre observasjoner beskrevet ovenfor antyder at GA-signalering sannsynligvis spiller en rolle i denne prosessen ved å regulere retningen for celledeling.
Tap av funksjon av flere DELLA-gener resulterer i en konstitutiv GA-respons, og della-mutanter kan brukes til å teste denne hypotesen44. Vi analyserte først ekspresjonsmønstrene til fem DELLA-gener i SAM. Transkripsjonell fusjon av GUS-linjen45 avslørte at GAI, RGA, RGL1 og RGL2 (i mye mindre grad) ble uttrykt i SAM (tilleggsfigur 11a–d). In situ hybridisering demonstrerte videre at GAI mRNA akkumuleres spesifikt i primordia og utviklende blomster (tilleggsfigur 11e). RGL1- og RGL3-mRNA ble påvist i hele SAM-tak og i eldre blomster, mens RGL2-mRNA var mer rikelig i grenseområdet (tilleggsfigur 11f–h). Konfokal avbildning av pRGL3::RGL3-GFP SAM bekreftet uttrykket observert ved in situ hybridisering og viste at RGL3-protein akkumuleres i den sentrale delen av SAM (Supplerende Fig. 11i). Ved å bruke pRGA::GFP-RGA-linjen fant vi også at RGA-protein akkumuleres i SAM, men dets overflod avtar ved grensen fra P4 (tilleggsfig. 11j). Spesielt er uttrykksmønstrene til RGL3 og RGA i samsvar med høyere GA-signaleringsaktivitet i IPR, som oppdaget av qmRGA (fig. 4). Dessuten indikerer disse dataene at alle DELLA-er er uttrykt i SAM og at uttrykket deres samlet spenner over hele SAM.
Vi analyserte deretter celledelingsparametrene i villtype SAM (Ler, kontroll) og gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della femdobbelt (globale) mutanter (fig. 6a, b). Interessant nok observerte vi et statistisk signifikant skifte i fordelingen av celledelingsvinkelfrekvenser i della global mutant SAM sammenlignet med villtypen (fig. 6c). Denne endringen i della global-mutanten skyldtes en økning i frekvensen på 80–90° vinkler (34,71 % vs. 24,55 %) og, i mindre grad, 70–80° vinkler (23,78 % vs. 20,18 %), dvs. tilsvarende tverrgående celledelinger (Fig. 6c). Frekvensen av ikke-tverrgående delinger (0–60°) var også lavere i della global mutant (fig. 6c). Frekvensen av tverrgående celledelinger ble betydelig økt i SAM av della global mutant (fig. 6b). Frekvensen av tverrgående celledelinger i IPR var også høyere i della global mutant sammenlignet med villtypen (fig. 6d). Utenfor IPR-regionen hadde villtypen en mer ensartet fordeling av celledelingsvinkler, mens della global-mutanten foretrakk tangentielle divisjoner som IPR (fig. 6e). Vi kvantifiserte også orienteringen av celledelinger i SAM av ga2-oksidase (ga2ox) femdobbelte mutanter (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 og ga2ox6-2), en GA-inaktiv mutantbakgrunn der GA akkumuleres. I samsvar med økningen i GA-nivåer, var SAM for den femdobbelte ga2ox-mutante blomsterstanden større enn den for Col-0 (Supplerende Fig. 12a, b), og sammenlignet med Col-0, viste den femdobbelte ga2ox SAM en tydelig forskjellig fordeling av celledelingsvinkler, med økende vinkelfrekvens til 500° tangensiell frekvens til igjen 500°. inndelinger (Supplerende Fig. 12a–c). Dermed viser vi at konstitutiv aktivering av GA-signalering og GA-akkumulering induserer laterale celledelinger i IPR og resten av SAM.
a, b 3D-visualisering av L1-laget av PI-farget Ler (a) og global della mutant (b) SAM ved bruk av konfokalmikroskopi. Nye cellevegger dannet i SAM (men ikke primordium) over en 10-timers periode vises og farges i henhold til deres vinkelverdier. Innsatsen viser SAM ved 0 timer. Fargelinjen vises i nedre høyre hjørne. Pilen i (b) peker på et eksempel på justerte cellefiler i den globale della-mutanten. Eksperimentet ble gjentatt to ganger med lignende resultater. ce sammenligning av frekvensfordelingen av celledelingsplanorienteringer i hele SAM (d), IPR (e) og ikke-IPR (f) mellom Ler og global della. P-verdier ble oppnådd ved å bruke en to-halet Kolmogorov-Smirnov-test. f, g 3D-visualisering av konfokale bilder av PI-farget SAM av Col-0 (i) og pCUC2::gai-1-VENUS (j) transgene planter. Paneler (a, b) viser nye cellevegger (men ikke primordia) dannet i SAM innen 10 timer. Eksperimentet ble gjentatt to ganger med lignende resultater. h–j Sammenligning av frekvensfordelingen av celledelingsplanorienteringer lokalisert i hele SAM (h), IPR (i) og ikke-IPR (j) mellom Col-0 og pCUC2::gai-1-VENUS-planter. P-verdier ble oppnådd ved å bruke en to-halet Kolmogorov-Smirnov-test.
Vi testet deretter effekten av å hemme GA-signalering spesifikt i IPR. For dette formål brukte vi cotyledon cup 2 (CUC2)-promotoren for å drive ekspresjon av et dominant negativt gai-1-protein fusjonert til VENUS (i pCUC2::gai-1-VENUS-linjen). I villtype SAM driver CUC2-promotoren ekspresjon av de fleste IPR-er i SAM, inkludert grenseceller, fra P4 og utover, og lignende spesifikt uttrykk ble observert i pCUC2::gai-1-VENUS-planter (se nedenfor). Fordelingen av celledelingsvinkler over SAM eller IPR til pCUC2::gai-1-VENUS-planter var ikke signifikant forskjellig fra villtypen, selv om vi uventet fant at celler uten IPR i disse plantene delte seg med en høyere frekvens på 80–90° (fig. 6f–j).
Det har blitt foreslått at retningen for celledeling avhenger av geometrien til SAM, spesielt strekkspenningen som genereres av vevskrumningen46. Vi spurte derfor om formen på SAM ble endret i della global mutant og pCUC2::gai-1-VENUS-planter. Som rapportert tidligere12, var størrelsen på della global mutant SAM større enn villtypen (tilleggsfigur 13a, b, d). In situ hybridisering av CLV3 og STM RNA bekreftet meristem-ekspansjonen i della-mutanter og viste videre den laterale utvidelsen av stamcellenisjen (tilleggsfigur 13e, f, h, i). Imidlertid var SAM-kurvaturen lik i begge genotypene (Supplerende Fig. 13k, m, n, p). Vi observerte en lignende økning i størrelse i gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della firedobbel mutant uten endring i krumning sammenlignet med villtypen (Supplerende figur 13c, d, g, j, l, o, p). Frekvensen av celledelingsorientering ble også påvirket i della quadruple mutant, men i mindre grad enn i della monolittisk mutant (Supplerende Fig. 12d–f). Denne doseringseffekten, sammen med mangelen på en effekt på krumning, antyder at gjenværende RGL3-aktivitet i Della-firedoblet mutant begrenser endringer i celledelingsorientering forårsaket av tap av DELLA-aktivitet og at endringer i laterale celledelinger oppstår som respons på endringer i GA-signalaktivitet i stedet for endringer i SAM-geometri. Som beskrevet ovenfor, driver CUC2-promotoren IPR-ekspresjon i SAM-en som starter ved P4 (tilleggsfigur 14a, b), og i motsetning til dette hadde pCUC2::gai-1-VENUS SAM redusert størrelse, men høyere krumning (tilleggsfigur 14c–h). Denne endringen i pCUC2::gai-1-VENUS SAM-morfologi kan resultere i en annen fordeling av mekaniske spenninger sammenlignet med villtypen, der høye periferiske spenninger starter i kortere avstand fra SAM-senteret47. Alternativt kan endringene i pCUC2::gai-1-VENUS SAM-morfologi skyldes endringer i regionale mekaniske egenskaper indusert av transgenekspresjon48. I begge tilfeller kan dette delvis oppveie effekten av endringer i GA-signalering ved å øke sannsynligheten for at celler vil dele seg i omkrets-/tverrretningen, noe som forklarer våre observasjoner.
Samlet bekrefter dataene våre at høyere GA-signalering spiller en aktiv rolle i den laterale orienteringen av celledelingsplanet i IPR. De viser også at meristem-krumning også påvirker orienteringen av celledelingsplanet i IPR.
Den tverrgående orienteringen av delingsplanet i IPR, på grunn av høy GA-signaleringsaktivitet, antyder at GA forhåndsorganiserer en radiell cellefil i epidermis i SAM for å definere den cellulære organisasjonen som senere vil bli funnet i den epidermale internoden. Slike cellefiler var faktisk ofte synlige i SAM-bilder av della globale mutanter (fig. 6b). For ytterligere å utforske utviklingsfunksjonen til det romlige mønsteret til GA-signalering i SAM, brukte vi time-lapse-avbildning for å analysere den romlige organiseringen av celler i IPR i villtype (Ler og Col-0), della globale mutanter og pCUC2::gai-1-VENUS transgene planter.
Vi fant at qmRGA viste at GA-signaleringsaktiviteten i IPR økte fra P1/P2 og nådde toppen ved P4, og dette mønsteret forble konstant over tid (fig. 4a–f og tilleggsfigur 8c–f, k). For å analysere den romlige organiseringen av celler i IPR med økende GA-signal, merket vi Ler IPR-celler over og til sidene av P4 i henhold til deres utviklingsskjebne analysert 34 timer etter første observasjon, dvs. mer enn to plastidtider, slik at vi kan følge IPR-celler under primordiumutvikling fra P1/P2 til P4. Vi brukte tre forskjellige farger: gul for de cellene som var integrert i primordium nær P4, grønn for de som var i IPR, og lilla for de som deltok i begge prosessene (fig. 7a–c). Ved t0 (0 timer) var 1–2 lag med IPR-celler synlige foran P4 (fig. 7a). Som forventet, når disse cellene delte seg, gjorde de det hovedsakelig via tverrdelingsplanet (fig. 7a–c). Lignende resultater ble oppnådd ved bruk av Col-0 SAM (med fokus på P3, hvis kantfolder på samme måte som P4 i Ler), selv om i denne genotypen folden dannet ved blomsterkanten skjulte IPR-cellene raskere (fig. 7g-i). Delingsmønsteret til IPR-celler forhåndsorganiserer cellene i radielle rader, som i internoder. Organiseringen av radielle rader og lokaliseringen av IPR-celler mellom påfølgende organer antyder at disse cellene er internodale stamceller.
Her utviklet vi en ratiometrisk GA-signaleringsbiosensor, qmRGA, som tillater kvantitativ kartlegging av GA-signalaktivitet som følge av kombinerte GA- og GA-reseptorkonsentrasjoner samtidig som interferens med endogene signalveier minimeres, og derved gir informasjon om GA-funksjon på cellenivå. For dette formål konstruerte vi et modifisert DELLA-protein, mRGA, som har mistet evnen til å binde DELLA-interaksjonspartnere, men forblir følsomt for GA-indusert proteolyse. qmRGA reagerer på både eksogene og endogene endringer i GA-nivåer, og dens dynamiske sanseegenskaper muliggjør vurdering av romlige endringer i GA-signalaktivitet under utvikling. qmRGA er også et veldig fleksibelt verktøy ettersom det kan tilpasses forskjellige vev ved å endre promoteren som brukes for dets uttrykk (om nødvendig), og gitt den bevarte naturen til GA-signalveien og PFYRE-motivet på tvers av angiospermer, vil det sannsynligvis være overførbart til andre arter22. I samsvar med dette ble en ekvivalent mutasjon i ris SLR1 DELLA-proteinet (HYY497AAA) også vist å undertrykke vekstrepressoraktiviteten til SLR1, mens den bare reduserte dens GA-medierte nedbrytning, lik mRGA23. Spesielt viste nyere studier i Arabidopsis at en enkelt aminosyremutasjon i PFYRE-domenet (S474L) endret transkripsjonsaktiviteten til RGA uten å påvirke dens evne til å samhandle med transkripsjonsfaktorpartnere50. Selv om denne mutasjonen er veldig nær de 3 aminosyresubstitusjonene som er tilstede i mRGA, viser våre studier at disse to mutasjonene endrer distinkte egenskaper til DELLA. Selv om de fleste transkripsjonsfaktorpartnere binder seg til LHR1- og SAW-domenene til DELLA26,51, kan noen konserverte aminosyrer i PFYRE-domenet bidra til å stabilisere disse interaksjonene.
Internodeutvikling er en nøkkelegenskap i plantearkitektur og avkastningsforbedring. qmRGA avslørte høyere GA-signaleringsaktivitet i IPR internode stamceller. Ved å kombinere kvantitativ avbildning og genetikk, viste vi at GA-signaleringsmønstre overlapper sirkulære/tverrgående celledelingsplaner i SAM-epidermis, og former celledelingsorganisasjonen som kreves for internodeutvikling. Flere regulatorer av celledelingsplanorientering er blitt identifisert under utvikling52,53. Vårt arbeid gir et tydelig eksempel på hvordan GA-signalaktivitet regulerer denne cellulære parameteren. DELLA kan samhandle med prefolding proteinkomplekser41, så GA-signalering kan regulere celledelingsplanorientering ved direkte å påvirke kortikale mikrotubuli-orientering40,41,54,55. Vi viste uventet at i SAM var korrelatet til høyere GA-signalaktivitet ikke celleforlengelse eller -deling, men bare vekstanisotropi, som er i samsvar med en direkte effekt av GA på retningen av celledeling i IPR. Vi kan imidlertid ikke utelukke at denne effekten også kan være indirekte, for eksempel mediert av GA-indusert celleveggmykning56. Endringer i celleveggegenskaper induserer mekanisk stress57,58, som også kan påvirke orienteringen av celledelingsplanet ved å påvirke orienteringen til kortikale mikrotubuli39,46,59. De kombinerte effektene av GA-indusert mekanisk stress og direkte regulering av mikrotubulus-orientering av GA kan være involvert i å generere et spesifikt mønster av celledelingsorientering i IPR for å definere internoder, og ytterligere studier er nødvendig for å teste denne ideen. Tilsvarende har tidligere studier fremhevet viktigheten av de DELLA-interagerende proteinene TCP14 og 15 i kontrollen av internodedannelse60,61 og disse faktorene kan mediere virkningen av GA sammen med BREVIPEDICELLUS (BP) og PENNYWISE (PNY), som regulerer internodeutvikling og har vist seg å påvirke,62GA-signalering2. Gitt at DELLA-er interagerer med brassinosteroid, etylen, jasmonsyre og abscisinsyre (ABA) signalveier63,64 og at disse hormonene kan påvirke mikrotubuli-orientering65, kan effekten av GA på celledelingsorientering også formidles av andre hormoner.
Tidlige cytologiske studier viste at både de indre og ytre områdene av Arabidopsis SAM er nødvendige for internodeutvikling2,42. Det faktum at GA aktivt regulerer celledeling i indre vev12 støtter en dobbel funksjon av GA i regulering av meristem og internodestørrelse i SAM. Mønsteret for retningsbestemt celledeling er også tett regulert i det indre SAM-vevet, og denne reguleringen er avgjørende for stamvekst52. Det vil være interessant å undersøke om GA også spiller en rolle i å orientere celledelingsplanet i den indre SAM-organisasjonen, og dermed synkronisere spesifikasjonen og utviklingen av internoder innenfor SAM.
Planter ble dyrket in vitro i jord eller 1x Murashige-Skoog (MS) medium (Duchefa) supplert med 1% sukrose og 1% agar (Sigma) under standardforhold (16 timer lys, 22 °C), bortsett fra hypokotyl- og rotveksteksperimenter der frøplanter ble dyrket på vertikale plater under konstant lys og 22 °C. For nitratforsøk ble planter dyrket på modifisert MS-medium (bioWORLD-plantemedium) supplert med tilstrekkelig nitrat (0 eller 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-suksinat, 1 % sukrose og 1 % A-agar (Sigma) under langdagsforhold.
GID1a cDNA satt inn i pDONR221 ble rekombinert med pDONR P4-P1R-pUBQ10 og pDONR P2R-P3-mCherry i pB7m34GW for å generere pUBQ10::GID1a-mCherry. IDD2 DNA satt inn i pDONR221 ble rekombinert inn i pB7RWG266 for å generere p35S:IDD2-RFP. For å generere pGID1b::2xmTQ2-GID1b, ble et 3,9 kb fragment oppstrøms for GID1b-kodende regionen og et 4,7 kb fragment inneholdende GID1b cDNA (1,3 kb) og terminator (3,4 kb) først amplifisert ved å bruke primerne i Supplerende Tabell 4-3 og deretter i PNRPrmo Fisher Scientific) og pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), henholdsvis, og til slutt rekombinert med pDONR221 2xmTQ268 inn i pGreen 012567 målvektoren ved bruk av Gateway-kloning. For å generere pCUC2::LSSmOrange, ble CUC2-promotersekvensen (3229 bp oppstrøms for ATG) etterfulgt av den kodende sekvensen til stor Stokes-skiftet mOrange (LSSmOrange)69 med N7-kjernelokaliseringssignalet og NOS-transkripsjonsterminatoren satt sammen i pGreenway-målvektoren-kanamybin-recomway-målvektoren- kanamybin-systemet for NOS. (Invitrogen). Den binære plantevektoren ble introdusert i Agrobacterium tumefaciens-stamme GV3101 og introdusert i Nicotiana benthamiana-blader ved henholdsvis Agrobacterium-infiltrasjonsmetoden og i Arabidopsis thaliana Col-0 ved floral dip-metoden. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry og pCLV3::mCherry-NLS qmRGA ble isolert fra henholdsvis F3- og F1-avkom av de respektive kryssene.
RNA in situ hybridisering ble utført på omtrent 1 cm lange skuddspisser72, som ble samlet og umiddelbart fiksert i FAA-løsning (3,7 % formaldehyd, 5 % eddiksyre, 50 % etanol) forhåndskjølt til 4 °C. Etter 2 × 15 min vakuumbehandlinger ble fikseringsmidlet skiftet og prøvene ble inkubert over natten. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 og RGL3 cDNA og antisense-prober til deres 3'-UTRs ble syntetisert ved å bruke primerne vist i tilleggstabell 3 som beskrevet av Rosier et al.73. Digoksigenin-merkede prober ble immundetektert ved bruk av digoksigenin-antistoffer (3000 ganger fortynning; Roche, katalognummer: 11 093 274 910), og seksjoner ble farget med 5-brom-4-klor-3-indolylfosfat (BCIP, 250 ganger diluet (Nrazol, 250 ganger diluet) 200 ganger fortynning) løsning.
Innleggstid: 10. februar 2025