Vekst av skuddspissmeristem (SAM) er kritisk for stengelarkitekturen. Plantehormonergibberelliner(GAer) spiller nøkkelroller i koordineringen av plantevekst, men deres rolle i SAM er fortsatt dårlig forstått. Her utviklet vi en ratiometrisk biosensor for GA-signalering ved å konstruere DELLA-proteinet for å undertrykke dets essensielle regulatoriske funksjon i GA-transkripsjonsresponsen, samtidig som det bevarer nedbrytningen ved GA-gjenkjenning. Vi demonstrerer at denne nedbrytningsbaserte biosensoren nøyaktig registrerer endringer i GA-nivåer og cellulær sensing under utvikling. Vi brukte denne biosensoren til å kartlegge GA-signalaktivitet i SAM. Vi viser at høye GA-signaler hovedsakelig er tilstede i celler som ligger mellom organprimordier, som er forløpere til internodeceller. Ved å bruke gain- og loss-of-function-tilnærminger demonstrerer vi videre at GA regulerer orienteringen av celledelingsplanet, og etablerer den kanoniske cellulære organiseringen av internoder, og dermed fremmer internodespesifikasjon i SAM.
Skuttspissens meristem (SAM), som ligger ved skuddspissen, inneholder en nisje av stamceller hvis aktivitet genererer laterale organer og stengelknuter på en modulær og iterativ måte gjennom plantens levetid. Hver av disse repeterende enhetene, eller planteknutene, inkluderer internoder og laterale organer ved nodene, og aksillære meristemer i bladhjørnene1. Veksten og organiseringen av planteknutene endres under utviklingen. Hos Arabidopsis undertrykkes internodal vekst i løpet av den vegetative fasen, og aksillære meristemer forblir sovende i bladhjørnene på rosettbladene. Under overgangen til blomsterfasen blir SAM blomsterstandsmeristemet, som genererer forlengede internoder og aksillære knopper, grener i bladhjørnene på blomstbladene og senere bladløse blomster2. Selv om vi har gjort betydelige fremskritt i å forstå mekanismene som kontrollerer initieringen av blader, blomster og grener, er det relativt lite kunnskap om hvordan internoder oppstår.
Å forstå den spatiotemporale fordelingen av GA-er vil bidra til å bedre forstå funksjonene til disse hormonene i forskjellige vev og på forskjellige utviklingsstadier. Visualisering av nedbrytningen av RGA-GFP-fusjon uttrykt under påvirkning av sin egen promotor gir viktig informasjon om reguleringen av totale GA-nivåer i røtter15,16. Imidlertid varierer RGA-ekspresjon på tvers av vev17 og reguleres av GA18. Dermed kan differensiell ekspresjon av RGA-promotoren resultere i fluorescensmønsteret observert med RGA-GFP, og dermed er denne metoden ikke kvantitativ. Nylig avslørte bioaktivt fluorescein (Fl)-merket GA19,20 akkumulering av GA i rotens endokortex og regulering av dens cellulære nivåer ved GA-transport. Nylig viste GA FRET-sensoren nlsGPS1 at GA-nivåer korrelerer med celleforlengelse i røtter, filamenter og mørkvoksne hypokotyler21. Imidlertid, som vi har sett, er GA-konsentrasjon ikke den eneste parameteren som kontrollerer GA-signalaktivitet, da den avhenger av komplekse sensorprosesser. Her, basert på vår forståelse av DELLA- og GA-signalveiene, rapporterer vi utviklingen og karakteriseringen av en degraderingsbasert ratiometrisk biosensor for GA-signalering. For å utvikle denne kvantitative biosensoren brukte vi en mutant GA-sensitiv RGA som var fusjonert til et fluorescerende protein og uttrykt ubikvitært i vev, samt et GA-usensitivt fluorescerende protein. Vi viser at de mutante RGA-proteinfusjonene ikke forstyrrer endogen GA-signalering når de uttrykes ubikvitært, og at denne biosensoren kan kvantifisere signalaktivitet som følge av både GA-input og GA-signalbehandling av sensorapparatet med høy spatiotemporal oppløsning. Vi brukte denne biosensoren til å kartlegge den spatiotemporale fordelingen av GA-signalaktivitet og kvantifisere hvordan GA regulerer cellulær atferd i SAM-epidermis. Vi demonstrerer at GA regulerer orienteringen av delingsplanet til SAM-celler som ligger mellom organprimordier, og dermed definerer den kanoniske cellulære organiseringen av internoden.
Til slutt spurte vi om qmRGA kunne rapportere endringer i endogene GA-nivåer ved bruk av voksende hypokotyler. Vi har tidligere vist at nitrat stimulerer vekst ved å øke GA-syntesen og dermed DELLA34-nedbrytningen. Følgelig observerte vi at hypokotyllengden i pUBQ10::qmRGA-frøplanter dyrket under rikelig nitrattilførsel (10 mM NO3−) var betydelig lengre enn i frøplanter dyrket under nitratfattige forhold (tilleggsfigur 6a). I samsvar med vekstresponsen var GA-signaler høyere i hypokotyler hos frøplanter dyrket under 10 mM NO3−-forhold enn hos frøplanter dyrket i fravær av nitrat (tilleggsfigur 6b, c). Dermed muliggjør qmRGA også overvåking av endringer i GA-signalering indusert av endogene endringer i GA-konsentrasjon.
For å forstå om GA-signalaktiviteten detektert av qmRGA avhenger av GA-konsentrasjon og GA-persepsjon, som forventet basert på sensordesignet, analyserte vi uttrykket av de tre GID1-reseptorene i vegetativt og reproduktivt vev. I frøplanter viste GID1-GUS-reporterlinjen at GID1a og c var høyt uttrykt i cotyledons (fig. 3a–c). I tillegg ble alle tre reseptorene uttrykt i blader, laterale rotprimordier, rotspisser (unntatt rothetten til GID1b) og det vaskulære systemet (fig. 3a–c). I blomsterstandens SAM detekterte vi bare GUS-signaler for GID1b og 1c (tilleggsfig. 7a–c). In situ-hybridisering bekreftet disse uttrykksmønstrene og demonstrerte videre at GID1c ble uttrykt jevnt på lave nivåer i SAM, mens GID1b viste høyere uttrykk i periferien av SAM (tilleggsfig. 7d–l). Den translasjonsmessige fusjonen pGID1b::2xmTQ2-GID1b avdekket også et gradert område av GID1b-ekspresjon, fra lav eller ingen ekspresjon i midten av SAM til høy ekspresjon ved organgrensene (tilleggsfigur 7m). Dermed er ikke GID1-reseptorer jevnt fordelt over og i vev. I påfølgende eksperimenter observerte vi også at overekspresjon av GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) økte følsomheten til qmRGA i hypokotyler for ekstern GA-applikasjon (figur 3d, e). I motsetning til dette var fluorescens målt ved qd17mRGA i hypokotylen ufølsom for GA3-behandling (figur 3f, g). For begge analysene ble frøplantene behandlet med høye konsentrasjoner av GA (100 μM GA3) for å vurdere sensorens raske oppførsel, der evnen til å binde seg til GID1-reseptoren ble forbedret eller tapt. Sammen bekrefter disse resultatene at qmRGA-biosensoren tjener en kombinert funksjon som en GA- og GA-sensor, og antyder at differensiell uttrykk av GID1-reseptoren kan modulere sensorens emissivitet betydelig.
Til dags dato er fordelingen av GA-signaler i SAM fortsatt uklar. Derfor brukte vi qmRGA-uttrykkende planter og pCLV3::mCherry-NLS stamcelle-reporteren35 for å beregne kvantitative kart med høy oppløsning over GA-signalaktivitet, med fokus på L1-laget (epidermis; fig. 4a, b, se Metoder og tilleggsmetoder), siden L1 spiller en nøkkelrolle i å kontrollere SAM-vekst36. Her ga pCLV3::mCherry-NLS-ekspresjon et fast geometrisk referansepunkt for å analysere den spatiotemporale fordelingen av GA-signalaktivitet37. Selv om GA anses som essensielt for lateral organutvikling4, observerte vi at GA-signalene var lave i blomsterprimordiet (P) fra P3-stadiet (fig. 4a, b), mens unge P1- og P2-primordier hadde moderat aktivitet som ligner på den i den sentrale regionen (fig. 4a, b). Høyere GA-signalaktivitet ble detektert ved organprimordiumgrensene, startende ved P1/P2 (på sidene av grensen) og med en topp ved P4, samt i alle celler i den perifere regionen som ligger mellom primordiene (fig. 4a, b og tilleggsfig. 8a, b). Denne høyere GA-signalaktiviteten ble observert ikke bare i epidermis, men også i L2- og øvre L3-lag (tilleggsfig. 8b). Mønsteret av GA-signaler detektert i SAM ved bruk av qmRGA forble også uendret over tid (tilleggsfig. 8c–f, k). Selv om qd17mRGA-konstruksjonen ble systematisk nedregulert i SAM av T3-planter fra fem uavhengige linjer som vi karakteriserte i detalj, var vi i stand til å analysere fluorescensmønstrene oppnådd med pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP-konstruksjonen (tilleggsfig. 8g–j, l). I denne kontrolllinjen ble det bare detektert mindre endringer i fluorescensforholdet i SAM, men i SAM-senteret observerte vi en klar og uventet reduksjon i VENUS assosiert med TagBFP. Dette bekrefter at signalmønsteret observert av qmRGA reflekterer GA-avhengig nedbrytning av mRGA-VENUS, men viser også at qmRGA kan overvurdere GA-signalaktivitet i meristemsenteret. Oppsummert viser resultatene våre et GA-signalmønster som primært reflekterer fordelingen av primordier. Denne fordelingen av den inter-primordiale regionen (IPR) skyldes den gradvise etableringen av høy GA-signalaktivitet mellom det utviklende primordiet og den sentrale regionen, samtidig som GA-signalaktiviteten i primordiet avtar (fig. 4c, d).
Fordelingen av GID1b- og GID1c-reseptorer (se ovenfor) antyder at differensiell uttrykk av GA-reseptorer bidrar til å forme mønsteret av GA-signalaktivitet i SAM. Vi lurte på om differensiell akkumulering av GA kunne være involvert. For å undersøke denne muligheten brukte vi nlsGPS1 GA FRET-sensoren21. Økt aktiveringsfrekvens ble oppdaget i SAM av nlsGPS1 behandlet med 10 μM GA4+7 i 100 minutter (tilleggsfigur 9a–e), noe som indikerer at nlsGPS1 reagerer på endringer i GA-konsentrasjon i SAM, slik det gjør i røtter21. Romlig fordeling av nlsGPS1-aktiveringsfrekvens viste relativt lave GA-nivåer i de ytre lagene av SAM, men viste at de var forhøyet i midten og ved grensene av SAM (figur 4e og tilleggsfigur 9a, c). Dette antyder at GA også er fordelt i SAM med et romlig mønster som kan sammenlignes med det som avsløres av qmRGA. Som en komplementær tilnærming behandlet vi også SAM med fluorescerende GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) eller Fl alene som en negativ kontroll. Fl-signalet var distribuert gjennom SAM, inkludert den sentrale regionen og primordium, om enn med en lavere intensitet (fig. 4j og tilleggsfig. 10d). I motsetning til dette akkumulerte alle tre GA-Fl spesifikt innenfor primordiumgrensene og i varierende grad i resten av IPR, med GA7-Fl som akkumulerte i det største domenet i IPR (fig. 4k og tilleggsfig. 10a,b). Kvantifisering av fluorescensintensitet viste at forholdet mellom IPR og ikke-IPR-intensitet var høyere i GA-Fl-behandlet SAM sammenlignet med Fl-behandlet SAM (fig. 4l og tilleggsfig. 10c). Sammen tyder disse resultatene på at GA er tilstede i høyere konsentrasjoner i IPR-celler som er lokalisert nærmest organgrensen. Dette tyder på at mønsteret av SAM GA-signaliseringsaktivitet skyldes både ulik uttrykk av GA-reseptorer og ulik akkumulering av GA i IPR-celler nær organgrenser. Vår analyse avdekket dermed et uventet spatiotemporalt mønster av GA-signalering, med lavere aktivitet i sentrum og primordium av SAM og høyere aktivitet i IPR i den perifere regionen.
For å forstå rollen til differensiell GA-signalaktivitet i SAM, analyserte vi korrelasjonen mellom GA-signalaktivitet, celleekspansjon og celledeling ved hjelp av sanntids timelapse-avbildning av SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Gitt GAs rolle i vekstregulering, var en positiv korrelasjon med celleekspansjonsparametere forventet. Derfor sammenlignet vi først kart over GA-signalaktivitet med kart over celleoverflatevekstrate (som en proxy for styrken av celleekspansjon for en gitt celle og for datterceller ved deling) og med kart over vekstanisotropi, som måler retningen til celleekspansjon (også brukt her for en gitt celle og for datterceller ved deling; fig. 5a, b, se Metoder og tilleggsmetoder). Våre kart over SAM-celleoverflatevekstrate er konsistente med tidligere observasjoner38,39, med minimale vekstrater ved grensen og maksimale vekstrater i utviklende blomster (fig. 5a). Hovedkomponentanalyse (PCA) viste at GA-signalaktivitet var negativt korrelert med celleoverflatevekstrate (figur 5c). Vi viste også at hovedaksene for variasjon, inkludert GA-signalinngang og vekstintensitet, var ortogonale til retningen bestemt av høy CLV3-ekspresjon, noe som bekreftet ekskluderingen av celler fra SAM-senteret i de gjenværende analysene. Spearman-korrelasjonsanalyse bekreftet PCA-resultatene (figur 5d), noe som indikerer at høyere GA-signaler i IPR ikke resulterte i høyere celleekspansjon. Korrelasjonsanalysen avdekket imidlertid en svak positiv korrelasjon mellom GA-signalaktivitet og vekstanisotropi (figur 5c, d), noe som tyder på at høyere GA-signalering i IPR påvirker retningen på cellevekst og muligens posisjonen til celledelingsplanet.
a, b Varmekart over gjennomsnittlig overflatevekst (a) og vekstanisotropi (b) i SAM gjennomsnittliggjort over syv uavhengige planter (brukt som proxyer for henholdsvis styrken og retningen på celleekspansjonen). c PCA-analyse inkluderte følgende variabler: GA-signal, overflatevekstintensitet, overflatevekstanisotropi og CLV3-ekspresjon. PCA-komponent 1 var hovedsakelig negativt korrelert med overflatevekstintensitet og positivt korrelert med GA-signal. PCA-komponent 2 var hovedsakelig positivt korrelert med overflatevekstanisotropi og negativt korrelert med CLV3-ekspresjon. Prosentandeler representerer variasjonen forklart av hver komponent. d Spearman-korrelasjonsanalyse mellom GA-signal, overflatevekstintensitet og overflatevekstanisotropi på vevsskala unntatt CZ. Tallet til høyre er Spearman rho-verdien mellom to variabler. Stjerner indikerer tilfeller der korrelasjonen/negativ korrelasjon er svært signifikant. e 3D-visualisering av Col-0 SAM L1-celler ved konfokalmikroskopi. Nye cellevegger dannet i SAM (men ikke primordium) etter 10 timer er farget i henhold til deres vinkelverdier. Fargelinjen vises nederst til høyre. Innsettet viser det tilsvarende 3D-bildet ved 0 timer. Eksperimentet ble gjentatt to ganger med lignende resultater. f Boksplott viser celledelingsrater i IPR og ikke-IPR Col-0 SAM (n = 10 uavhengige planter). Senterlinjen viser medianen, og boksgrensene indikerer 25. og 75. persentil. Værhår indikerer minimums- og maksimumsverdiene bestemt med R-programvare. P-verdier ble oppnådd med Welchs tosidige t-test. g, h Skjematisk diagram som viser (g) hvordan man måler vinkelen til den nye celleveggen (magenta) i forhold til radialretningen fra midten av SAM (hvit stiplet linje) (kun spisse vinkelverdier, dvs. 0–90°, tas i betraktning), og (h) omkrets-/lateral- og radialretningene innenfor meristemet. i Frekvenshistogrammer for celledelingsplanorientering over henholdsvis SAM (mørkeblå), IPR (middelsblå) og ikke-IPR (lyseblå). P-verdier ble oppnådd ved en tosidig Kolmogorov-Smirnov-test. Eksperimentet ble gjentatt to ganger med lignende resultater. j Frekvenshistogrammer av celledelingsplanorienteringen til IPR rundt henholdsvis P3 (lysegrønn), P4 (middels grønn) og P5 (mørkegrønn). P-verdier ble oppnådd ved en tosidig Kolmogorov-Smirnov-test. Eksperimentet ble gjentatt to ganger med lignende resultater.
Derfor undersøkte vi deretter korrelasjonen mellom GA-signalering og celledelingsaktivitet ved å identifisere nydannede cellevegger under analysen (fig. 5e). Denne tilnærmingen tillot oss å måle frekvensen og retningen av celledelingen. Overraskende nok fant vi at frekvensen av celledelinger i IPR og resten av SAM (ikke-IPR, fig. 5f) var lik, noe som indikerer at forskjeller i GA-signalering mellom IPR- og ikke-IPR-celler ikke påvirker celledelingen signifikant. Dette, og den positive korrelasjonen mellom GA-signalering og vekstanisotropi, fikk oss til å vurdere om GA-signaliseringsaktivitet kunne påvirke orienteringen av celledelingsplanet. Vi målte orienteringen til den nye celleveggen som en spiss vinkel i forhold til den radielle aksen som forbinder meristemsenteret og sentrum av den nye celleveggen (fig. 5e-i) og observerte en klar tendens til at celler deler seg i vinkler nær 90° i forhold til den radielle aksen, med de høyeste frekvensene observert ved 70–80° (23,28 %) og 80–90° (22,62 %) (fig. 5e,i), som tilsvarer celledelinger i omkrets-/tverrretningen (fig. 5h). For å undersøke bidraget fra GA-signalering til denne celledelingsatferden, analyserte vi celledelingsparametere i IPR og ikke-IPR separat (fig. 5i). Vi observerte at delingsvinkelfordelingen i IPR-celler skilte seg fra den i ikke-IPR-celler eller i celler i hele SAM, med IPR-celler som viste en høyere andel laterale/sirkulære celledelinger, dvs. 70–80° og 80–90° (henholdsvis 33,86 % og 30,71 %, tilsvarende proporsjoner) (fig. 5i). Våre observasjoner viste dermed en sammenheng mellom høy GA-signalering og en celledelingsplanorientering nær omkretsretningen, lik korrelasjonen mellom GA-signalaktivitet og vekstanisotropi (fig. 5c, d). For å ytterligere etablere den romlige bevaringen av denne sammenhengen, målte vi delingsplanorienteringen i IPR-celler rundt primordium startende fra P3, siden den høyeste GA-signalaktiviteten ble oppdaget i denne regionen startende fra P4 (fig. 4). Delingsvinklene til IPR rundt P3 og P4 viste ingen statistisk signifikante forskjeller, selv om en økt frekvens av laterale celledelinger ble observert i IPR rundt P4 (fig. 5j). I IPR-cellene rundt P5 ble imidlertid forskjellen i orienteringen av celledelingsplanet statistisk signifikant, med en kraftig økning i hyppigheten av transversale celledelinger (fig. 5j). Sammen tyder disse resultatene på at GA-signalering kan kontrollere orienteringen av celledelinger i SAM, noe som er i samsvar med tidligere rapporter40,41 om at høy GA-signalering kan indusere lateral orientering av celledelinger i IPR.
Det er spådd at celler i IPR ikke vil bli inkorporert i primordia, men snarere i internoder2,42,43. Den tverrgående orienteringen av celledelinger i IPR kan resultere i den typiske organiseringen av parallelle longitudinelle rader av epidermale celler i internoder. Våre observasjoner beskrevet ovenfor antyder at GA-signalering sannsynligvis spiller en rolle i denne prosessen ved å regulere retningen på celledeling.
Funksjonstap av flere DELLA-gener resulterer i en konstitutiv GA-respons, og della-mutanter kan brukes til å teste denne hypotesen44. Vi analyserte først uttrykksmønstrene til fem DELLA-gener i SAM. Transkripsjonell fusjon av GUS-linjen45 viste at GAI, RGA, RGL1 og RGL2 (i mye mindre grad) ble uttrykt i SAM (tilleggsfigur 11a–d). In situ-hybridisering viste videre at GAI mRNA akkumuleres spesifikt i primordia og utviklende blomster (tilleggsfigur 11e). RGL1- og RGL3-mRNA ble detektert i hele SAM-kronen og i eldre blomster, mens RGL2 mRNA var mer rikelig i grenseområdet (tilleggsfigur 11f–h). Konfokal avbildning av pRGL3::RGL3-GFP SAM bekreftet uttrykket observert ved in situ-hybridisering og viste at RGL3-protein akkumuleres i den sentrale delen av SAM (tilleggsfigur 11i). Ved å bruke pRGA::GFP-RGA-linjen fant vi også at RGA-protein akkumuleres i SAM, men mengden avtar ved grensen fra P4 (tilleggsfigur 11j). Det er verdt å merke seg at uttrykksmønstrene til RGL3 og RGA er konsistente med høyere GA-signalaktivitet i IPR, slik det oppdages av qmRGA (figur 4). Dessuten indikerer disse dataene at alle DELLA-er uttrykkes i SAM, og at uttrykket deres samlet spenner over hele SAM.
Vi analyserte deretter celledelingsparametrene i villtype-SAM (Ler, kontroll) og gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (globale) mutanter (fig. 6a, b). Interessant nok observerte vi et statistisk signifikant skifte i fordelingen av celledelingsvinkelfrekvenser i della global-mutanten SAM sammenlignet med villtypen (fig. 6c). Denne endringen i della global-mutanten skyldtes en økning i frekvensen av 80–90° vinkler (34,71 % vs. 24,55 %) og, i mindre grad, 70–80° vinkler (23,78 % vs. 20,18 %), dvs. tilsvarende transversale celledelinger (fig. 6c). Frekvensen av ikke-transversale delinger (0–60°) var også lavere i della global-mutanten (fig. 6c). Frekvensen av transversale celledelinger var betydelig økt i SAM til della global-mutanten (fig. 6b). Hyppigheten av transversale celledelinger i IPR var også høyere i della global-mutanten sammenlignet med villtypen (fig. 6d). Utenfor IPR-regionen hadde villtypen en mer jevn fordeling av celledelingsvinkler, mens della global-mutanten foretrakk tangentielle delinger som IPR (fig. 6e). Vi kvantifiserte også orienteringen av celledelinger i SAM til ga2-oksidase (ga2ox) femtedelte mutanter (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 og ga2ox6-2), en GA-inaktiv mutantbakgrunn der GA akkumuleres. I samsvar med økningen i GA-nivåer var SAM-en til den femdoble ga2ox-mutantblomsterstanden større enn den til Col-0 (tilleggsfigur 12a, b), og sammenlignet med Col-0 viste den femdoble ga2ox-SAM-en en tydelig forskjellig fordeling av celledelingsvinkler, med en økning i vinkelfrekvensen fra 50° til 90°, dvs. igjen favorisering av tangentielle delinger (tilleggsfigur 12a–c). Dermed viser vi at konstitutiv aktivering av GA-signalering og GA-akkumulering induserer laterale celledelinger i IPR og resten av SAM.
a, b 3D-visualisering av L1-laget av PI-farget Ler (a) og global della-mutant (b) SAM ved bruk av konfokalmikroskopi. Nye cellevegger dannet i SAM (men ikke primordium) over en 10-timers periode vises og farges i henhold til vinkelverdiene deres. Innsettet viser SAM ved 0 timer. Fargelinjen vises i nedre høyre hjørne. Pilen i (b) peker på et eksempel på justerte cellefiler i den globale della-mutanten. Eksperimentet ble gjentatt to ganger med lignende resultater. ce-sammenligning av frekvensfordelingen av celledelingsplanorienteringer i hele SAM (d), IPR (e) og ikke-IPR (f) mellom Ler og global della. P-verdier ble oppnådd ved bruk av en tosidig Kolmogorov-Smirnov-test. f, g 3D-visualisering av konfokale bilder av PI-farget SAM av Col-0 (i) og pCUC2::gai-1-VENUS (j) transgene planter. Panelene (a, b) viser nye cellevegger (men ikke primordia) dannet i SAM innen 10 timer. Eksperimentet ble gjentatt to ganger med lignende resultater. h–j Sammenligning av frekvensfordelingen av celledelingsplanorienteringer lokalisert i hele SAM (h), IPR (i) og ikke-IPR (j) mellom Col-0 og pCUC2::gai-1-VENUS-planter. P-verdier ble oppnådd ved hjelp av en tosidig Kolmogorov–Smirnov-test.
Deretter testet vi effekten av å hemme GA-signalering spesifikt i IPR. For dette formålet brukte vi cotyledon cup 2 (CUC2)-promotoren til å drive uttrykk av et dominant negativt gai-1-protein fusjonert til VENUS (i pCUC2::gai-1-VENUS-linjen). I villtype-SAM driver CUC2-promotoren uttrykk av de fleste IPR-er i SAM, inkludert kantceller, fra P4 og utover, og lignende spesifikk uttrykk ble observert i pCUC2::gai-1-VENUS-planter (se nedenfor). Fordelingen av celledelingsvinkler over SAM eller IPR i pCUC2::gai-1-VENUS-planter var ikke signifikant forskjellig fra villtypen, selv om vi uventet fant at celler uten en IPR i disse plantene delte seg med en høyere frekvens på 80–90° (fig. 6f–j).
Det har blitt foreslått at retningen på celledeling avhenger av geometrien til SAM, spesielt strekkspenningen generert av vevskurvaturen46. Vi spurte derfor om formen på SAM var endret i della global mutant- og pCUC2::gai-1-VENUS-plantene. Som tidligere rapportert12, var størrelsen på della global mutant-SAM større enn for villtypen (tilleggsfigur 13a, b, d). In situ-hybridisering av CLV3 og STM RNA bekreftet meristem-ekspansjonen i della-mutanter og viste videre den laterale ekspansjonen av stamcelle-nisjen (tilleggsfigur 13e, f, h, i). SAM-krumningen var imidlertid lik i begge genotypene (tilleggsfigur 13k, m, n, p). Vi observerte en lignende økning i størrelse i gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della firedobbeltmutanten uten endring i krumning sammenlignet med villtypen (tilleggsfigur 13c, d, g, j, l, o, p). Hyppigheten av celledelingsorientering ble også påvirket i della-kvadrupelmutanten, men i mindre grad enn i della-monolitmutanten (tilleggsfigur 12d–f). Denne doseringseffekten, sammen med mangelen på en effekt på krumning, antyder at gjenværende RGL3-aktivitet i Della-kvadrupelmutanten begrenser endringer i celledelingsorientering forårsaket av tap av DELLA-aktivitet, og at endringer i laterale celledelinger skjer som respons på endringer i GA-signalaktivitet snarere enn endringer i SAM-geometri. Som beskrevet ovenfor driver CUC2-promotoren IPR-ekspresjon i SAM startende ved P4 (tilleggsfigur 14a, b), og i kontrast hadde pCUC2::gai-1-VENUS SAM en redusert størrelse, men høyere krumning (tilleggsfigur 14c–h). Denne endringen i pCUC2::gai-1-VENUS SAM-morfologi kan resultere i en annen fordeling av mekaniske belastninger sammenlignet med villtypen, der høye omkretsbelastninger starter på kortere avstand fra SAM-senteret 47. Alternativt kan endringene i pCUC2::gai-1-VENUS SAM-morfologien skyldes endringer i regionale mekaniske egenskaper indusert av transgenekspresjon48. I begge tilfeller kan dette delvis oppveie effektene av endringer i GA-signalering ved å øke sannsynligheten for at cellene vil dele seg i omkrets-/tverrgående retning, noe som forklarer observasjonene våre.
Samlet sett bekrefter dataene våre at høyere GA-signalering spiller en aktiv rolle i den laterale orienteringen av celledelingsplanet i IPR. De viser også at meristemkrumningen også påvirker orienteringen av celledelingsplanet i IPR.
Den tverrgående orienteringen av delingsplanet i IPR, på grunn av høy GA-signalaktivitet, antyder at GA forhåndsorganiserer en radiell cellefil i epidermis i SAM for å definere den cellulære organisasjonen som senere vil bli funnet i den epidermale internoden. Faktisk var slike cellefiler ofte synlige i SAM-bilder av della global-mutanter (fig. 6b). For å utforske den utviklingsmessige funksjonen til det romlige mønsteret av GA-signalering i SAM ytterligere, brukte vi derfor time-lapse-avbildning for å analysere den romlige organiseringen av celler i IPR i villtype (Ler og Col-0), della global-mutanter og pCUC2::gai-1-VENUS transgene planter.
Vi fant at qmRGA viste at GA-signalaktiviteten i IPR økte fra P1/P2 og nådde toppen ved P4, og dette mønsteret forble konstant over tid (fig. 4a–f og tilleggsfig. 8c–f, k). For å analysere den romlige organiseringen av celler i IPR med økende GA-signal, merket vi Ler IPR-celler over og på sidene av P4 i henhold til deres utviklingsmessige skjebne analysert 34 timer etter første observasjon, dvs. mer enn to plastidtider, slik at vi kunne følge IPR-celler under primordiumutvikling fra P1/P2 til P4. Vi brukte tre forskjellige farger: gul for de cellene som var integrert i primordium nær P4, grønn for de som var i IPR, og lilla for de som deltok i begge prosessene (fig. 7a–c). Ved t0 (0 timer) var 1–2 lag med IPR-celler synlige foran P4 (fig. 7a). Som forventet, da disse cellene delte seg, gjorde de det hovedsakelig via det tverrgående delingsplanet (fig. 7a–c). Lignende resultater ble oppnådd ved bruk av Col-0 SAM (med fokus på P3, hvis kant folder seg på samme måte som P4 i Ler), selv om folden dannet ved blomsterkanten i denne genotypen skjulte IPR-cellene raskere (fig. 7g–i). Dermed forhåndsorganiserer delingsmønsteret til IPR-celler cellene i radiale rader, som i internoder. Organiseringen av radiale rader og lokaliseringen av IPR-celler mellom påfølgende organer antyder at disse cellene er internodale progenitorer.
Her utviklet vi en ratiometrisk GA-signaliseringsbiosensor, qmRGA, som muliggjør kvantitativ kartlegging av GA-signaliseringsaktivitet som følge av kombinerte GA- og GA-reseptorkonsentrasjoner, samtidig som den minimerer interferens med endogene signalveier, og dermed gir informasjon om GA-funksjon på cellenivå. For dette formålet konstruerte vi et modifisert DELLA-protein, mRGA, som har mistet evnen til å binde DELLA-interaksjonspartnere, men som fortsatt er følsomt for GA-indusert proteolyse. qmRGA reagerer på både eksogene og endogene endringer i GA-nivåer, og dens dynamiske sensoregenskaper muliggjør vurdering av spatiotemporale endringer i GA-signaliseringsaktivitet under utvikling. qmRGA er også et veldig fleksibelt verktøy, da det kan tilpasses forskjellige vev ved å endre promoteren som brukes for uttrykket (om nødvendig), og gitt den konserverte naturen til GA-signalveien og PFYRE-motivet på tvers av angiospermer, er det sannsynlig at det kan overføres til andre arter22. I samsvar med dette ble det også vist at en tilsvarende mutasjon i ris-SLR1 DELLA-proteinet (HYY497AAA) undertrykker vekstrepressoraktiviteten til SLR1, samtidig som den bare reduserer dens GA-medierte nedbrytning litt, i likhet med mRGA23. Det er verdt å merke seg at nyere studier i Arabidopsis viste at en enkelt aminosyremutasjon i PFYRE-domenet (S474L) endret transkripsjonsaktiviteten til RGA uten å påvirke dens evne til å samhandle med transkripsjonsfaktorpartnere50. Selv om denne mutasjonen er svært nær de tre aminosyresubstitusjonene som finnes i mRGA, viser studiene våre at disse to mutasjonene endrer distinkte egenskaper ved DELLA. Selv om de fleste transkripsjonsfaktorpartnere binder seg til LHR1- og SAW-domenene til DELLA26,51, kan noen konserverte aminosyrer i PFYRE-domenet bidra til å stabilisere disse interaksjonene.
Internodeutvikling er et nøkkeltrekk i plantearkitektur og avlingsforbedring. qmRGA avdekket høyere GA-signalaktivitet i IPR-internodeprogenitorceller. Ved å kombinere kvantitativ avbildning og genetikk viste vi at GA-signalmønstre legger sirkulære/tverrgående celledelingsplaner over hverandre i SAM-epidermis, og former celledelingsorganisasjonen som kreves for internodeutvikling. Flere regulatorer av celledelingsplanorientering har blitt identifisert under utviklingen52,53. Vårt arbeid gir et tydelig eksempel på hvordan GA-signalaktivitet regulerer denne cellulære parameteren. DELLA kan samhandle med prefoldingsproteinkomplekser41, slik at GA-signalering kan regulere celledelingsplanorientering ved å direkte påvirke kortikal mikrotubuliorientering40,41,54,55. Vi viste uventet at i SAM var korrelatet med høyere GA-signalaktivitet ikke celleforlengelse eller -deling, men bare vekstanisotropi, noe som er i samsvar med en direkte effekt av GA på retningen av celledeling i IPR. Vi kan imidlertid ikke utelukke at denne effekten også kan være indirekte, for eksempel mediert av GA-indusert mykgjøring av cellevegger56. Endringer i celleveggens egenskaper induserer mekanisk stress57,58, som også kan påvirke orienteringen av celledelingsplanet ved å påvirke orienteringen av kortikale mikrotubuli39,46,59. De kombinerte effektene av GA-indusert mekanisk stress og direkte regulering av mikrotubuliorientering av GA kan være involvert i å generere et spesifikt mønster av celledelingsorientering i IPR for å definere internoder, og ytterligere studier er nødvendige for å teste denne ideen. Tilsvarende har tidligere studier fremhevet viktigheten av DELLA-interagerende proteiner TCP14 og 15 i kontrollen av internodedannelse60,61, og disse faktorene kan mediere virkningen av GA sammen med BREVIPEDICELLUS (BP) og PENNYWISE (PNY), som regulerer internodeutvikling og har vist seg å påvirke GA-signalering2,62. Gitt at DELLA-er samhandler med signalveier for brassinosteroid, etylen, jasmonsyre og abscisinsyre (ABA)63,64, og at disse hormonene kan påvirke mikrotubuli-orienteringen65, kan effektene av GA på celledelingsorientering også medieres av andre hormoner.
Tidlige cytologiske studier viste at både de indre og ytre områdene av Arabidopsis SAM er nødvendige for internodeutvikling2,42. Det faktum at GA aktivt regulerer celledeling i det indre vevet12 støtter en dobbel funksjon av GA i å regulere meristem- og internodestørrelse i SAM. Mønsteret for retningsbestemt celledeling er også strengt regulert i det indre SAM-vevet, og denne reguleringen er essensiell for stilkvekst52. Det vil være interessant å undersøke om GA også spiller en rolle i å orientere celledelingsplanet i den indre SAM-organiseringen, og dermed synkronisere spesifikasjonen og utviklingen av internoder i SAM.
Planter ble dyrket in vitro i jord eller 1x Murashige-Skoog (MS) medium (Duchefa) tilsatt 1 % sukrose og 1 % agar (Sigma) under standardforhold (16 timer lys, 22 °C), med unntak av hypokotyl- og rotvekstforsøk der frøplantene ble dyrket på vertikale plater under konstant lys og 22 °C. For nitratforsøk ble plantene dyrket på modifisert MS-medium (bioWORLD plantemedium) tilsatt tilstrekkelig nitrat (0 eller 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-suksinat, 1 % sukrose og 1 % A-agar (Sigma) under lange dagsforhold.
GID1a cDNA satt inn i pDONR221 ble rekombinert med pDONR P4-P1R-pUBQ10 og pDONR P2R-P3-mCherry inn i pB7m34GW for å generere pUBQ10::GID1a-mCherry. IDD2 DNA satt inn i pDONR221 ble rekombinert inn i pB7RWG266 for å generere p35S:IDD2-RFP. For å generere pGID1b::2xmTQ2-GID1b ble et 3,9 kb fragment oppstrøms for GID1b-kodingsregionen og et 4,7 kb fragment som inneholdt GID1b-cDNA (1,3 kb) og terminator (3,4 kb) først amplifisert ved bruk av primerne i tilleggstabell 3 og deretter satt inn i henholdsvis pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) og pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), og til slutt rekombinert med pDONR221 2xmTQ268 inn i pGreen 012567-målvektoren ved bruk av Gateway-kloning. For å generere pCUC2::LSSmOrange ble CUC2-promotorsekvensen (3229 bp oppstrøms for ATG) etterfulgt av kodingssekvensen til stor Stokes-skiftet mOrange (LSSmOrange)69 med N7-nukleærlokaliseringssignalet og NOS-transkripsjonsterminatoren satt sammen i pGreen kanamycin-målrettingsvektoren ved bruk av Gateway 3-fragment rekombinasjonssystemet (Invitrogen). Den binære plantens vektor ble introdusert i Agrobacterium tumefaciens-stammen GV3101 og introdusert i Nicotiana benthamiana-blader ved hjelp av Agrobacterium-infiltrasjonsmetoden og i Arabidopsis thaliana Col-0 ved hjelp av blomsterdyppemetoden. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry og pCLV3::mCherry-NLS qmRGA ble isolert fra henholdsvis F3- og F1-avkommet fra de respektive krysningene.
RNA in situ-hybridisering ble utført på omtrent 1 cm lange skuddspisser72, som ble samlet og umiddelbart fiksert i FAA-løsning (3,7 % formaldehyd, 5 % eddiksyre, 50 % etanol) forkjølt til 4 °C. Etter 2 × 15 minutters vakuumbehandlinger ble fikseringsmiddelet endret og prøvene ble inkubert over natten. GID1a-, GID1b-, GID1c-, GAI-, RGL1-, RGL2- og RGL3-cDNA-er og antisense-prober til deres 3'-UTR-er ble syntetisert ved bruk av primerne vist i tilleggstabell 3 som beskrevet av Rosier et al.73. Digoksigenin-merkede prober ble immunodetektert ved bruk av digoksigenin-antistoffer (3000-ganger fortynning; Roche, katalognummer: 11 093 274 910), og snittene ble farget med 5-brom-4-klor-3-indolylfosfat (BCIP, 250-ganger fortynning)/nitroblått tetrazolium (NBT, 200-ganger fortynning)-løsning.
Publisert: 10. feb. 2025