I denne studien ble de stimulerende effektene av den kombinerte behandlingen avplantevekstregulatorer(2,4-D og kinetin) og jernoksid-nanopartikler (Fe₃O₄-NP) på in vitro-morfogenese og produksjon av sekundær metabolitt i *Hypericum perforatum* L. ble undersøkt. Den optimaliserte behandlingen [2,4-D (0,5 mg/L) + kinetin (2 mg/L) + Fe₃O₄-NP (4 mg/L)] forbedret plantevekstparametrene betydelig: plantehøyden økte med 59,6 %, rotlengden med 114,0 %, knopptallet med 180,0 % og kallusvekten med 198,3 % sammenlignet med kontrollgruppen. Denne kombinerte behandlingen forbedret også regenereringseffektiviteten (50,85 %) og økte hypericininnholdet med 66,6 %. GC-MS-analyse viste høyt innhold av hyperosid, β-patolen og cetylalkohol, som utgjorde 93,36 % av det totale topparealet, mens innholdet av totale fenoler og flavonoider økte med så mye som 80,1 %. Disse resultatene indikerer at plantevekstregulatorer (PGR-er) og Fe₃O₄-nanopartikler (Fe₃O₄-NP-er) utøver en synergistisk effekt ved å stimulere organogenese og akkumulering av bioaktive forbindelser, noe som representerer en lovende strategi for bioteknologisk forbedring av medisinplanter.
Johannesurt (Hypericum perforatum L.), også kjent som johannesurt, er en flerårig urteaktig plante av familien Hypericaceae som har økonomisk verdi.[1] Dens potensielle bioaktive komponenter inkluderer naturlige tanniner, xantoner, floroglucinol, naftalendiantron (hyperin og pseudohyperin), flavonoider, fenolsyrer og essensielle oljer.[2,3,4] Johannesurt kan formeres med tradisjonelle metoder. Sesongvariasjonene i tradisjonelle metoder, lav frøspiring og mottakelighet for sykdommer begrenser imidlertid potensialet for storskala dyrking og kontinuerlig dannelse av sekundære metabolitter.[1,5,6]
In vitro-vevskultur anses derfor som en effektiv metode for rask planteformering, bevaring av kimplasmeressurser og økt utbytte av medisinske forbindelser [7, 8]. Plantevekstregulatorer (PGR-er) spiller en avgjørende rolle i reguleringen av morfogenese og er nødvendige for in vitro-dyrking av kallus og hele organismer. Optimalisering av konsentrasjonene og kombinasjonene deres er avgjørende for en vellykket gjennomføring av disse utviklingsprosessene [9]. Derfor er det viktig å forstå riktig sammensetning og konsentrasjon av regulatorer for å forbedre veksten og regenereringskapasiteten til johannesurt (H. perforatum) [10].
Jernoksid-nanopartikler (Fe₃O₄) er en klasse nanopartikler som har blitt eller er under utvikling for vevskultur. Fe₃O₄ har betydelige magnetiske egenskaper, god biokompatibilitet og evnen til å fremme plantevekst og redusere miljøstress, så det har fått betydelig oppmerksomhet innen vevskulturdesign. Potensielle bruksområder for disse nanopartiklene kan omfatte optimalisering av in vitro-kultur for å fremme celledeling, forbedre næringsopptak og aktivere antioksidantenzymer [11].
Selv om nanopartikler har vist gode effekter som fremmer plantevekst, er studier av kombinert bruk av Fe₃O₄ nanopartikler og optimaliserte plantevekstregulatorer i *H. perforatum* fortsatt mangelvare. For å fylle dette kunnskapsgapet evaluerte denne studien effektene av deres kombinerte effekter på in vitro morfogenese og produksjon av sekundær metabolitt for å gi ny innsikt for å forbedre egenskapene til medisinplanter. Derfor har denne studien to mål: (1) optimalisere konsentrasjonen av plantevekstregulatorer for effektivt å fremme kallusdannelse, skuddregenerering og rotdannelse in vitro; og (2) evaluere effektene av Fe₃O₄ nanopartikler på vekstparametere in vitro. Fremtidige planer inkluderer evaluering av overlevelsesraten for regenererte planter under akklimatisering (in vitro). Det forventes at resultatene av denne studien vil forbedre mikropropageringseffektiviteten til *H. perforatum* betydelig, og dermed bidra til bærekraftig bruk og bioteknologiske anvendelser av denne viktige medisinplanten.
I denne studien hentet vi bladeksplanter fra feltdyrkede ettårige johannesurtplanter (morplanter). Disse eksplantatene ble brukt til å optimalisere in vitro-dyrkingsforhold. Før dyrking ble bladene grundig skylt under rennende destillert vann i flere minutter. Eksplantasjonsoverflatene ble deretter desinfisert ved nedsenking i 70 % etanol i 30 sekunder, etterfulgt av nedsenking i en 1,5 % natriumhypokloritt (NaOCl)-løsning som inneholdt noen få dråper Tween 20 i 10 minutter. Til slutt ble eksplantatene skylt tre ganger med sterilt destillert vann før de ble overført til neste dyrkingsmedium.
I løpet av de neste fire ukene ble skuddregenereringsparametrene målt, inkludert regenereringsrate, antall skudd per eksplantat og skuddlengde. Når regenererte skudd nådde en lengde på minst 2 cm, ble de overført til et rotmedium bestående av halvstyrke MS-medium, 0,5 mg/L indolsmørsyre (IBA) og 0,3 % guargummi. Rotkulturen fortsatte i tre uker, og i løpet av denne tiden ble rothastighet, antall røtter og rotlengde målt. Hver behandling ble gjentatt tre ganger, med 10 eksplantater dyrket per replikat, noe som ga omtrent 30 eksplantater per behandling.
Plantehøyden ble målt i centimeter (cm) ved hjelp av en linjal, fra plantens base til spissen av det høyeste bladet. Rotlengden ble målt i millimeter (mm) umiddelbart etter at frøplantene var forsiktig fjernet og vekstmediet ble fjernet. Antall knopper per eksplantat ble telt direkte på hver plante. Antall svarte flekker på bladene, kjent som knuter, ble målt visuelt. Disse svarte knutene antas å være kjertler som inneholder hypericin, eller oksidative flekker, og brukes som en fysiologisk indikator på plantens respons på behandling. Etter å ha fjernet alt vekstmediet ble frøplantenes ferske vekt målt ved hjelp av en elektronisk vekt med en nøyaktighet på milligram (mg).
Metoden for å beregne hastigheten på kallusdannelse er som følger: etter dyrking av eksplantater i et medium som inneholder forskjellige vekstregulatorer (kinaser, 2,4-D og Fe3O4) i fire uker, telles antallet eksplantater som er i stand til å danne kallus. Formelen for å beregne hastigheten på kallusdannelse er som følger:
Hver behandling ble gjentatt tre ganger, med minst 10 eksplantater undersøkt i hver repetisjon.
Regenereringsraten gjenspeiler andelen av kallusvev som fullfører knoppdifferensieringsprosessen etter kallusdannelsesstadiet. Denne indikatoren viser kallusvevets evne til å transformeres til differensiert vev og vokse til nye planteorganer.
Rotningskoeffisienten er forholdet mellom antall grener som er i stand til å rote seg og det totale antallet grener. Denne indikatoren gjenspeiler hvor vellykket rotingsfasen er, som er avgjørende i mikroformering og planteformering, ettersom god roting hjelper frøplanter med å overleve bedre under vekstforhold.
Hypericinforbindelser ble ekstrahert med 90 % metanol. Femti mg tørket plantemateriale ble tilsatt 1 ml metanol og sonikert i 20 minutter ved 30 kHz i en ultralydrenser (modell A5120-3YJ) ved romtemperatur i mørket. Etter sonikering ble prøven sentrifugert ved 6000 rpm i 15 minutter. Supernatanten ble samlet opp, og absorbansen til hypericin ble målt ved 592 nm ved bruk av et Plus-3000 S spektrofotometer i henhold til metoden beskrevet av Conceiçao et al. [14].
De fleste behandlinger med plantevekstregulatorer (PGR-er) og jernoksid-nanopartikler (Fe₃O₄-NP-er) induserte ikke dannelse av svarte noduler på regenererte skuddblader. Ingen noduler ble observert i noen av behandlingene med 0,5 eller 1 mg/L 2,4-D, 0,5 eller 1 mg/L kinetin, eller 1, 2 eller 4 mg/L jernoksid-nanopartikler. Noen få kombinasjoner viste en liten økning i nodulutvikling (men ikke statistisk signifikant) ved høyere konsentrasjoner av kinetin og/eller jernoksid-nanopartikler, slik som kombinasjonen av 2,4-D (0,5–2 mg/L) med kinetin (1–1,5 mg/L) og jernoksid-nanopartikler (2–4 mg/L). Disse resultatene er vist i figur 2. Svarte noduler representerer hypericinrike kjertler, både naturlig forekommende og gunstige. I denne studien var svarte noduler hovedsakelig assosiert med brunfarging av vev, noe som indikerer et gunstig miljø for akkumulering av hypericin. Behandling med 2,4-D, kinetin og Fe₃O₄ nanopartikler fremmet kallusvekst, redusert brunfarging og økt klorofyllinnhold, noe som tyder på forbedret metabolsk funksjon og potensiell reduksjon av oksidativ skade [37]. Denne studien evaluerte effekten av kinetin i kombinasjon med 2,4-D og Fe₃O₄ nanopartikler på vekst og utvikling av johannesurtkallus (fig. 3a–g). Tidligere studier har vist at Fe₃O₄ nanopartikler har soppdrepende og antimikrobielle aktiviteter [38, 39], og når de brukes i kombinasjon med plantevekstregulatorer, kan de stimulere planteforsvarsmekanismer og redusere cellulære stressindekser [18]. Selv om biosyntesen av sekundære metabolitter er genetisk regulert, er deres faktiske utbytte sterkt avhengig av miljøforhold. Metabolske og morfologiske endringer kan påvirke nivåene av sekundære metabolitter ved å regulere uttrykket av spesifikke plantegener og reagere på miljøfaktorer. Videre kan indusere utløse aktiveringen av nye gener, som igjen stimulerer enzymatisk aktivitet, noe som til slutt aktiverer flere biosyntetiske veier og fører til dannelsen av sekundære metabolitter. Videre viste en annen studie at redusert skyggelegging øker sollyseksponeringen, og dermed øker dagtemperaturen i det naturlige habitatet til *Hypericum perforatum*, noe som også bidrar til økt hypericinutbytte. Basert på disse dataene undersøkte denne studien rollen til jernnanopartikler som potensielle indusere i vevskultur. Resultatene viste at disse nanopartiklene kan aktivere gener involvert i hesperidinbiosyntese gjennom enzymatisk stimulering, noe som fører til økt akkumulering av denne forbindelsen (fig. 2). Sammenlignet med planter som vokser under naturlige forhold, kan det derfor argumenteres for at produksjonen av slike forbindelser in vivo også kan forbedres når moderat stress kombineres med aktivering av gener involvert i biosyntesen av sekundære metabolitter. Kombinasjonsbehandlinger har generelt en positiv effekt på regenereringshastigheten, men i noen tilfeller svekkes denne effekten. Det er verdt å merke seg at behandling med 1 mg/L 2,4-D, 1,5 mg/L kinase og forskjellige konsentrasjoner uavhengig og betydelig kunne øke regenereringshastigheten med 50,85 % sammenlignet med kontrollgruppen (fig. 4c). Disse resultatene tyder på at spesifikke kombinasjoner av nanohormoner kan virke synergistisk for å fremme plantevekst og metabolittproduksjon, noe som er av stor betydning for vevskultur av medisinplanter. Palmer og Keller [50] viste at 2,4-D-behandling uavhengig kunne indusere kallusdannelse i St. perforatum, mens tilsetning av kinase betydelig forbedret kallusdannelse og regenerering. Denne effekten skyldtes forbedringen av hormonbalansen og stimulering av celledeling. Bal et al. [51] fant at Fe₃O₄-NP-behandling uavhengig kunne forbedre funksjonen til antioksidantenzymer, og dermed fremme rotvekst i St. perforatum. Kulturmedier som inneholder Fe₃O₄-nanopartikler i konsentrasjoner på 0,5 mg/L, 1 mg/L og 1,5 mg/L forbedret regenereringshastigheten til linplanter [52]. Bruken av kinetin, 2,4-diklorbenzotiazolinon og Fe₃O₄ nanopartikler forbedret kallus- og rotdannelsesratene betydelig. Imidlertid må de potensielle bivirkningene ved bruk av disse hormonene til in vitro-regenerering vurderes. For eksempel kan langvarig eller høykonsentrert bruk av 2,4-diklorbenzotiazolinon eller kinetin føre til somatisk klonal variasjon, oksidativt stress, unormal kallusmorfologi eller vitrifikasjon. Derfor predikerer ikke en høy regenereringsrate nødvendigvis genetisk stabilitet. Alle regenererte planter bør vurderes ved hjelp av molekylære markører (f.eks. RAPD, ISSR, AFLP) eller cytogenetisk analyse for å bestemme deres homogenitet og likhet med in vivo-planter [53,54,55].
Denne studien viste for første gang at kombinert bruk av plantevekstregulatorer (2,4-D og kinetin) med Fe₃O₄ nanopartikler kan forbedre morfogenese og akkumulering av viktige bioaktive metabolitter (inkludert hypericin og hyperosid) i *Hypericum perforatum*. Det optimaliserte behandlingsregimet (1 mg/L 2,4-D + 1 mg/L kinetin + 4 mg/L Fe₃O₄-NP-er) maksimerte ikke bare kallusdannelse, organogenese og sekundær metabolittutbytte, men viste også en mild induserende effekt, som potensielt forbedrer plantens stresstoleranse og medisinske verdi. Kombinasjonen av nanoteknologi og plantevevskultur gir en bærekraftig og effektiv plattform for storskala in vitro-produksjon av medisinske forbindelser. Disse resultatene baner vei for industrielle anvendelser og fremtidig forskning på molekylære mekanismer, doseringsoptimalisering og genetisk presisjon, og kobler dermed grunnleggende forskning på medisinplanter med praktisk bioteknologi.
Publiseringstidspunkt: 12. desember 2025