Det ormemiddelet N,N-dietyl-m-toluamid (DEET) har vist seg å hemme AChE (acetylkolinesterase) og har potensielt kreftfremkallende egenskaper på grunn av overdreven vaskularisering. I denne artikkelen viser vi at DEET spesifikt stimulerer endotelceller som fremmer angiogenese, og dermed øker tumorvekst. DEET aktiverer cellulære prosesser som fører til angiogenese, inkludert proliferasjon, migrasjon og adhesjon. Dette er assosiert med økt NO-produksjon og VEGF-ekspresjon i endotelceller. Demping av M3 eller bruk av farmakologiske M3-hemmere opphevet alle disse effektene, noe som tyder på at DEET-indusert angiogenese er M3-sensitiv. Eksperimenter som involverer kalsiumsignalering i endotel- og HEK-celler som overuttrykker M3-reseptorer, samt bindings- og dockingstudier, indikerer at DEET fungerer som en allosterisk modulator av M3-reseptorer. Videre hemmer DEET AChE, og øker dermed biotilgjengeligheten av acetylkolin og dets binding til M3-reseptorer, og forsterker proangiogene effekter gjennom allosterisk regulering.
Primære EC-er ble isolert fra aortaen til sveitsiske mus. Ekstraksjonsmetoden ble tilpasset fra Kobayashi-protokollen 26. Murine EC-er ble dyrket i EBM-2-medium tilsatt 5 % varmeinaktivert FBS frem til fjerde passasje.
Effekten av to konsentrasjoner av DEET på proliferasjonen av HUVEC, U87MG eller BF16F10 ble analysert ved hjelp av CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026). Kort fortalt ble 5,103 celler per brønn sådd i en 96-brønnsplate, fikk feste seg over natten og deretter behandlet med DEET i 24 timer. Etter fjerning av vekstmediet, tilsett fargestoffbindende løsning til hver brønn i mikroplaten og inkuber cellene ved 37 °C i 30 minutter. Fluorescensnivåer ble bestemt ved hjelp av en Mithras LB940 multimodus mikroplateleser (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Tyskland) utstyrt med 485 nm eksitasjonsfiltre og 530 nm emisjonsfiltre.
HUVEC ble sådd i 96-brønnsplater med en tetthet på 104 celler per brønn. Cellene ble behandlet med DEET i 24 timer. Cellelevedyktighet ble vurdert ved hjelp av en kolorimetrisk MTT-analyse (Sigma-Aldrich, M5655). Optiske tetthetsverdier ble oppnådd på en multimodus mikroplateleser (Mithras LB940) ved en bølgelengde på 570 nm.
Effektene av DEET ble studert ved hjelp av in vitro angiogeneseanalyser. Behandling med 10⁻⁶ M eller 10⁻⁶ M DEET økte dannelsen av kapillærlengde i HUVEC-er (fig. 1a, b, hvite søyler). Sammenlignet med kontrollgruppen viste behandling med DEET-konsentrasjoner fra 10⁻⁴ til 10⁻⁶ M at kapillærlengden nådde et platå ved 10⁻⁶ M DEET (tilleggsfig. S2). Ingen signifikant forskjell ble funnet i den in vitro proangiogene effekten av HUVEC-er behandlet med DEET i konsentrasjonsområdet 10⁻⁶ M og 10⁻⁶ M.
For å bestemme effekten av DEET på neovaskularisering utførte vi in vivo neovaskulariseringsstudier. Etter 14 dager viste mus injisert med endotelceller fordyrket med 10⁻⁶ M eller 10⁻⁶ M DEET en signifikant økning i hemoglobininnhold (fig. 1c, hvite søyler).
Videre ble DEET-indusert neovaskularisering studert i U87MG xenograftbærende mus som ble injisert daglig (ip) med DEET i en dose kjent for å indusere plasmakonsentrasjoner på 10⁻⁶ M, noe som er normalt hos eksponerte mennesker. i 23. Detekterbare svulster (dvs. svulster >100 mm3) ble observert 14 dager etter injeksjon av U87MG-celler i mus. På dag 28 var tumorveksten betydelig forbedret hos DEET-behandlede mus sammenlignet med kontrollmus (fig. 1d, firkanter). Videre viste CD31-farging av svulster at DEET økte kapillærarealet betydelig, men ikke mikrokartettheten. (fig. 1e–g).
For å bestemme rollen til muskarinreseptorer i DETA-indusert proliferasjon ble 10⁻⁶ M eller 10⁻⁶ M DETA i nærvær av pFHHSiD (10⁻⁶ M, en selektiv M3-reseptorantagonist) brukt. Behandling av HUVEC. pFHHSiD blokkerte fullstendig de proliferative egenskapene til DETA ved alle konsentrasjoner (tabell 1).
Under disse forholdene undersøkte vi også om DEET ville øke kapillærlengden i HUVEC-celler. På samme måte forhindret pFHHSiD betydelig DEET-indusert kapillærlengde (fig. 1a, b, grå søyler). Videre ble lignende eksperimenter utført med M3 siRNA. Selv om kontroll siRNA ikke var effektivt i å fremme kapillærdannelse, opphevet silencing av M3 muskarinreseptoren DEETs evne til å øke kapillærlengden (fig. 1a, b, svarte søyler).
Videre ble både 10⁻⁶ M eller 10⁻⁶ M DEET-indusert vaskularisering in vitro og neovaskularisering in vivo fullstendig blokkert av pFHHSiD (fig. 1c, d, sirkler). Disse resultatene indikerer at DEET fremmer angiogenese gjennom en responsvei som er følsom for selektive M3-reseptorantagonister eller M3 siRNA.
AChE er det molekylære målet for DEET. Legemidler som donepezil, som fungerer som AChE-hemmere, kan stimulere EC-angiogenese in vitro og i iskemimodeller for bakben hos mus14. Vi testet effekten av to konsentrasjoner av DEET på AChE-enzymaktivitet i HUVEC. Lave (10⁻⁶ M) og høye (10⁻⁶ M) konsentrasjoner av DEET reduserte endotelial AChE-aktivitet sammenlignet med kontrollforhold (fig. 2).
Begge konsentrasjonene av DEET (10⁻⁶ M og 10⁻⁶ M) reduserte acetylkolinesteraseaktiviteten på HUVEC. BW284c51 (10⁻⁶ M) ble brukt som kontroll for acetylkolinesterasehemmere. Resultatene er uttrykt som prosentandel av AChE-aktivitet på HUVEC behandlet med de to konsentrasjonene av DEET sammenlignet med celler behandlet med vehikkel. Verdiene er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM av seks uavhengige eksperimenter. *p < 0,05 sammenlignet med kontroll (Kruskal-Wallis og Dunn multippel sammenligningstest).
Nitrogenoksid (NO) er involvert i den angiogene prosessen 33, derfor ble NO-produksjon i DEET-stimulerte HUVEC-er studert. DEET-behandlet endotel NO-produksjon var økt sammenlignet med kontrollceller, men nådde bare signifikans ved en dose på 10⁻⁶ M (fig. 3c). For å bestemme de molekylære endringene som kontrollerer DEET-indusert NO-produksjon, ble eNOS-ekspresjon og -aktivering analysert ved Western blotting. Selv om DEET-behandling ikke endret eNOS-ekspresjon, økte den signifikant eNOS-fosforylering på aktiveringsstedet (Ser-1177) samtidig som den reduserte hemmende stedet (Thr-495) sammenlignet med ubehandlede celler i eNOS-fosforylering (fig. 3d). Videre ble forholdet mellom fosforylert eNOS på aktiveringsstedet og hemmende stedet beregnet etter normalisering av mengden fosforylert eNOS til den totale mengden enzym. Dette forholdet var signifikant økt i HUVEC-er behandlet med hver konsentrasjon av DEET sammenlignet med ubehandlede celler (fig. 3d).
Til slutt ble uttrykket av VEGF, en av de viktigste proangiogene faktorene, analysert ved Western blotting. DEET økte VEGF-uttrykket signifikant, mens pFHHSiD blokkerte dette uttrykket fullstendig.
Siden effektene av DEET er følsomme for både farmakologisk blokade og nedregulering av M3-reseptorer, testet vi hypotesen om at DEET kan forsterke kalsiumsignalering. Overraskende nok klarte ikke DEET å øke cytoplasmatisk kalsium i HUVEC (data ikke vist) og HEK/M3 (fig. 4a, b) for begge de brukte konsentrasjonene.
Publiseringstid: 30. desember 2024