Det anthelmintiske stoffet N,N-dietyl-m-toluamid (DEET) har blitt rapportert å hemme AChE (acetylkolinesterase) og har potensielle kreftfremkallende egenskaper på grunn av overdreven vaskularisering. I denne artikkelen viser vi at DEET spesifikt stimulerer endotelceller som fremmer angiogenese, og dermed øker tumorveksten. DEET aktiverer cellulære prosesser som fører til angiogenese, inkludert spredning, migrasjon og adhesjon. Dette er assosiert med økt NO-produksjon og VEGF-ekspresjon i endotelceller. Demping av M3 eller bruk av farmakologiske M3-hemmere opphevet alle disse effektene, noe som tyder på at DEET-indusert angiogenese er M3-sensitiv. Eksperimenter som involverer kalsiumsignalering i endotel- og HEK-celler som overuttrykker M3-reseptorer, samt bindings- og dockingstudier, indikerer at DEET fungerer som en allosterisk modulator av M3-reseptorer. Videre hemmer DEET AChE, og øker dermed biotilgjengeligheten av acetylkolin og dets binding til M3-reseptorer, og øker proangiogene effekter gjennom allosterisk regulering.
Primære EC-er ble isolert fra aorta til sveitsiske mus. Ekstraksjonsmetoden ble tilpasset fra Kobayashi-protokollen 26 . Murine EC-er ble dyrket i EBM-2-medium supplert med 5% varmeinaktivert FBS til den fjerde passasjen.
Effekten av to konsentrasjoner av DEET på spredningen av HUVEC, U87MG eller BF16F10 ble analysert ved å bruke CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026). Kort fortalt ble 5,103 celler per brønn sådd i en 96-brønners plate, tillatt å feste seg over natten og deretter behandlet med DEET i 24 timer. Etter å ha fjernet vekstmediet, tilsett fargestoffbindende løsning til hver brønn på mikroplaten og inkuber cellene ved 37 °C i 30 minutter. Fluorescensnivåer ble bestemt ved bruk av en Mithras LB940 multimodus mikroplateleser (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Tyskland) utstyrt med 485 nm eksitasjonsfiltre og 530 nm emisjonsfiltre.
HUVEC ble sådd i 96-brønners plater med en tetthet på 104 celler per brønn. Celler ble behandlet med DEET i 24 timer. Cellelevedyktighet ble vurdert ved bruk av en kolorimetrisk MTT-analyse (Sigma-Aldrich, M5655). Optiske tetthetsverdier ble oppnådd på en multimodus mikroplateleser (Mithras LB940) ved en bølgelengde på 570 nm.
Effektene av DEET ble studert ved å bruke in vitro angiogenese-analyser. Behandling med 10-8 M eller 10-5 M DEET økte dannelsen av kapillærlengde i HUVEC-er (fig. 1a, b, hvite søyler). Sammenlignet med kontrollgruppen viste behandling med DEET-konsentrasjoner fra 10-14 til 10-5 M at kapillærlengden nådde et platå ved 10-8 M DEET (Supplerende Fig. S2). Ingen signifikant forskjell ble funnet i den in vitro proangiogene effekten av HUVEC-er behandlet med DEET i konsentrasjonsområdet 10-8 M og 10-5 M.
For å bestemme effekten av DEET på neovaskularisering, utførte vi in vivo neovaskulariseringsstudier. Etter 14 dager viste mus injisert med endotelceller prekulturert med 10-8 M eller 10-5 M DEET en signifikant økning i hemoglobininnhold (fig. 1c, hvite søyler).
Videre ble DEET-indusert neovaskularisering studert i U87MG xenograft-bærende mus som ble injisert daglig (ip) med DEET i en dose kjent for å indusere plasmakonsentrasjoner på 10-5 M, som er normalt hos eksponerte mennesker. i 23. Detekterbare svulster (dvs. svulster >100 mm3) ble observert 14 dager etter injeksjon av U87MG-celler i mus. På dag 28 var tumorveksten betydelig forbedret i DEET-behandlede mus sammenlignet med kontrollmus (fig. 1d, firkanter). Videre viste CD31-farging av svulster at DEET betydelig økte kapillærområdet, men ikke mikrokar-tettheten. (Fig. 1e–g).
For å bestemme rollen til muskarine reseptorer i DETA-indusert proliferasjon, ble 10-8 M eller 10-5 M DETA i nærvær av pFHHSiD (10-7 M, en selektiv M3-reseptorantagonist) brukt. Behandling av HUVEC. pFHHSiD blokkerte fullstendig de proliferative egenskapene til DETA ved alle konsentrasjoner (tabell 1).
Under disse forholdene undersøkte vi også om DEET ville øke kapillærlengden i HUVEC-celler. Tilsvarende forhindret pFHHSiD betydelig DEET-indusert kapillærlengde (fig. 1a, b, grå søyler). Videre ble lignende eksperimenter utført med M3 siRNA. Selv om kontroll-siRNA ikke var effektiv for å fremme kapillærdannelse, opphevet lyddemping av M3-muskarinreseptoren DEETs evne til å øke kapillærlengden (fig. 1a, b, svarte søyler).
Videre ble både 10-8 M eller 10-5 M DEET-indusert vaskularisering in vitro og neovaskularisering in vivo fullstendig blokkert av pFHHSiD (fig. 1c, d, sirkler). Disse resultatene indikerer at DEET fremmer angiogenese gjennom en vei som er følsom for selektive M3-reseptorantagonister eller M3 siRNA.
AChE er det molekylære målet for DEET. Legemidler som donepezil, som fungerer som AChE-hemmere, kan stimulere EC angiogenese in vitro og i musebakbensiskemimodeller14. Vi testet effekten av to konsentrasjoner av DEET på AChE-enzymaktivitet i HUVEC. Lave (10-8 M) og høye (10-5 M) konsentrasjoner av DEET reduserte endotelial AChE-aktivitet sammenlignet med kontrollforhold (fig. 2).
Begge konsentrasjoner av DEET (10-8 M og 10-5 M) reduserte acetylkolinesteraseaktivitet på HUVEC. BW284c51 (10-5 M) ble brukt som en kontroll for acetylkolinesterasehemmere. Resultatene er uttrykt som prosentandel av AChE-aktivitet på HUVEC behandlet med de to konsentrasjonene av DEET sammenlignet med bærerbehandlede celler. Verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM av seks uavhengige eksperimenter. *p < 0,05 sammenlignet med kontroll (Kruskal-Wallis og Dunn multippel sammenligningstest).
Nitrogenoksid (NO) er involvert i den angiogene prosessen 33, derfor ble NO-produksjon i DEET-stimulerte HUVEC-er studert. DEET-behandlet endotelial NO-produksjon ble økt sammenlignet med kontrollceller, men nådde betydning kun ved en dose på 10-8 M (fig. 3c). For å bestemme de molekylære endringene som kontrollerer DEET-indusert NO-produksjon, ble eNOS-ekspresjon og aktivering analysert ved Western blotting. Selv om DEET-behandling ikke endret eNOS-ekspresjon, økte den signifikant eNOS-fosforylering ved dets aktiveringssted (Ser-1177) mens det reduserte dets hemmende sete (Thr-495) sammenlignet med ubehandlede celler i eNOS-fosforylering (fig. 3d). Videre ble forholdet mellom fosforylert eNOS på aktiveringsstedet og inhiberingsstedet beregnet etter normalisering av mengden fosforylert eNOS til den totale mengden enzym. Dette forholdet ble betydelig økt i HUVECs behandlet med hver konsentrasjon av DEET sammenlignet med ubehandlede celler (fig. 3d).
Til slutt ble uttrykket av VEGF, en av de viktigste proangiogene faktorene, analysert ved Western blotting. DEET økte VEGF-ekspresjonen betydelig, mens pFHHSiD fullstendig blokkerte dette uttrykket.
Siden effekten av DEET er følsom for både farmakologisk blokade og nedregulering av M3-reseptorer, testet vi hypotesen om at DEET kan forbedre kalsiumsignalering. Overraskende nok klarte DEET ikke å øke cytoplasmatisk kalsium i HUVEC (data ikke vist) og HEK/M3 (fig. 4a, b) for begge konsentrasjonene som ble brukt.
Innleggstid: 30. desember 2024