Plantevernmidler spiller en kritisk rolle i å håndtere global matmangel og bekjempe vektorbårne menneskelige sykdommer. Det økende problemet med plantevernmiddelresistens krever imidlertid oppdagelsen av nye forbindelser som retter seg mot underutnyttede mål. Insekttransientreseptorpotensial (TRPV)-kanaler – Nanzhong (Nan) og inaktive (Iav) – kan danne heterologe kanaler (Nan-Iav) og lokaliseres til mekanosensoriske organer som medierer geotropisme, hørsel og propriosepsjon hos insekter. Noen plantevernmidler, som aphidopyrrolidon (AP), retter seg mot Nan-Iav gjennom ukjente mekanismer. AP er effektivt mot piercingsugende insekter (hemipteraner), og forhindrer mating ved å forstyrre filamentenes funksjon. AP kan bare binde seg til Nan, men bare Nan-Iav kan samhandle med agonister, inkludert endogent nikotinamid (NAM), og dermed vise kanalaktivitet. Til tross for Nan-Iavs potensial som et insektmiddelmål, er det lite kjent om kanalsammensetningen, regulatoriske bindingssteder og Ca2+-avhengig regulering, noe som hindrer videre insektmiddelutvikling. I denne studien ble kryoelektronmikroskopi brukt til å bestemme strukturen til Nan-Iav i Hemiptera-insekter i calmodulin-ligand-fri tilstand, samt med AP og NAM ved grensen til det ankyrin-repeterende cytoplasmatiske domenet (ARD). Overraskende nok fant vi at Nan-proteinet i seg selv kan danne en pentamer, som stabiliseres av AP-medierte ARD-interaksjoner. Denne studien avslører molekylære interaksjoner mellom insektmidler og agonister og Nan-Iav, og fremhever viktigheten av ARD i kanalfunksjon og -samling, og utforsker mekanismen for Ca2+-regulering.
Med tanke på stadig mer alvorlige globale klimaendringer er forverret global matsikkerhet en av de største utfordringene i det 21. århundre, med kaskaderende konsekvenser for samfunnet.1,2Verdens helseorganisasjons rapport om matsikkerhet og ernæring i verden 2023 (SOFI) anslår at omtrent 2,33 milliarder mennesker verden over lider av moderat til alvorlig matusikkerhet, et langvarig problem.3,4Dessverre går anslagsvis 20 % til 30 % eller mer av avlingene tapt årlig til skadedyr og patogener, og global oppvarming forventes å forverre skadedyrresistens og avlingenes sårbarhet.4, 5, 6, 7, 8Utvikling av plantevernmidler er avgjørende ikke bare for å beskytte avlinger mot skadedyr og redusere spredningen av vektorbårne patogener, men også for å bekjempe vektorbårne menneskelige sykdommer som denguefeber, malaria og Chagas sykdom, som i økende grad er resistente mot plantevernmidler.5, 9, 10, 11
Blant de viktigste målene for nevrotoksiske insektmidler representerer den heterotetrameriske TRPV-kanalen Nanchung (Nan)-Inactive (Iav) en klasse insektmiddelmål som bare ble oppdaget i løpet av det siste tiåret, inkludert kommersielt tilgjengelige insektmidler som imidakloprid og pyraklostrobin.12,13,14Det semisyntetiske insektmidlet aphidopyrrolifen (AP) er et nylig utviklet og kommersialisert produkt hvis hovedkomponent er det aktive insektmidlet Inscalis®, som binder AP på et subnanomolart aktivitetsnivå.15AP viser lav akutt toksisitet for pollinatorer, nyttige insekter og andre ikke-målorganismer, og når det brukes i henhold til instruksjonene på etiketten, kan det redusere resistenspresset mot andre insektmidler.16,17,18Nan og Iav er vidt distribuert på tvers av insektarter, uttrykkes kun samtidig i kordale strekkreseptorneuroner i antennene og lemmene, og er kritiske for hørsel, tyngdekraftspersepsjon og propriosepsjon.13, 16, 19, 20, 21, 22AP, imidakloprid og pyraklostrobin stimulerer Nan-Iav-komplekset gjennom en unik mekanisme, som til slutt hemmer proprioseptiv signaltransduksjon.13,16,23Hos piercing-sugende insekter (hemipteraner) som bladlus og hvitfluer, svekker tap av propriosepsjon deres spiseevne, noe som til slutt fører til døden.13,24Interessant nok viser AP høy affinitet for Nan-Iav-komplekset og lav affinitet for Nan alene. Binding av AP til Nan-Iav induserer en elektrisk strøm, men binding til Nan alene stimulerer ikke kanalaktivitet. Iav i seg selv binder seg ikke til AP i det hele tatt.16Dette tyder på at Nan og Iav kan binde seg til forskjellige Nan-Iav-kanalkomplekser (f.eks. med forskjellige støkiometriske forhold eller forskjellige arrangementer innenfor samme støkiometriske forhold), eller at AP kan binde seg til flere steder. Videre binder den naturlige agonisten nikotinamid (NAM) seg til Drosophila Nan-Iav med mikromolar affinitet, og viser effekter som ligner på de hos bladlus (AP) in vitro.16,25og hemmer bladlusens reproduksjon og næring, noe som til slutt fører til deres død25,26Disse dataene reiser mange spørsmål. For eksempel er det fortsatt uklart hvordan Nan-Iav-heterodimeren dannes, hvilke bindingssteder som brukes til å modulere små molekyler, og hvordan disse små molekylene regulerer kanalfunksjonen ved å undertrykke propriosepsjon. Videre er årsakene til at Nan i seg selv er inaktivt og har lav affinitet for AP, mens Nan-Iav-heterodimeren er aktiv og binder AP med høyere affinitet, fortsatt uklare. Til slutt er det lite kjent om den Ca2+-avhengige reguleringen av Nan-Iav-funksjonen og hvordan den er integrert i nevrale signalprosesser.. 13,21
I denne studien, som kombinerte kryo-elektronmikroskopi, elektrofysiologi og radioligandbindingsteknikker, belyste vi sammensetningen av Nan-Iav og mekanismen for dets binding til småmolekylregulatorer. Videre oppdaget vi konstitutivt bundet kalmodulin (CaM) til Iav og AP-stabiliserte Nan-pentamerer. Disse resultatene gir viktig innsikt i reguleringen av kalsiumioner i kanaler, kanalsammensetning og faktorene som bestemmer ligandbindingsaffinitet. Enda viktigere er det at vi bekreftet at ARD spiller en sentral rolle i disse prosessene. Vår studie av komplette insektkanaler bundet til relevante landbruksplantevernmidler27, 28, 29åpner opp muligheter for utvikling av plantevernmiddelindustrien, forbedrer effektiviteten og spesifisiteten til plantevernmidler, og muliggjør bruk av TRPV-målrettede forbindelser på andre arter for å håndtere global matsikkerhet og spredning av vektorbårne sykdommer.
Vi fant også at Nan-Iav reguleres av Ca2+, og reguleringsmekanismen medieres av konstitutivt bundet CaM. Det er viktig å merke seg at denne Ca2+-avhengige reguleringen av Nav av CaM skiller seg betydelig fra reguleringsmekanismene til andre ionekanaler (f.eks. spenningsstyrte Na+-kanaler og TRPV5/6-kanaler).52, 53, 54, 55, 56, 57I Nav1.2-kanalen assosieres C-terminaldomenet til CaM spiralformet med C-terminaldomenet (CTD), og Ca2+ induserer binding av dets N-terminale domene til den distale delen av CTD.56I TRPV5/6-kanalen binder det C-terminale domenet til CaM seg til CTH, og Ca2+ induserer oppoverrettet forlengelse av dets N-terminale domene inn i porene, og blokkerer dermed kationpermeabilitet.53,54Vi foreslår en modell for den Ca2+-regulerte funksjonen til Nan-Iav-CaM (fig. 4h). I denne modellen binder det N-terminale domenet til CaM seg konstitutivt til det C-terminale domenet (CTH) til Iav. I hviletilstand (lav [Ca2+]-konsentrasjon) samhandler det C-terminale domenet til CaM med Nan, stabiliserer ARD-konformasjonen og fremmer dermed kanalåpning. Binding av en agonist/insekticid til kanalen induserer poreåpning, noe som fører til Ca2+-tilstrømning. Ca2+ binder seg deretter til CaM, noe som forårsaker dissosiasjon av det C-terminale domenet fra ARD-en til Nan. Fordi blokkering av CaM-binding i hovedsak opphever den hemmende effekten av Ca2+, modulerer denne dissosiasjonen ARD-mobilitet, og forårsaker dermed Ca2+-avhengig hemming eller desensibilisering. Den raske gjenopprettingen av kanalstrømmer etter kalsiumioneluering (fig. 4g) antyder at denne mekanismen muliggjør raske responser på Ca2+-medierte nevrale signaler. Videre er det rapportert at C-terminalregionen til Iav, som fortsatt er dårlig forstått, spiller andre roller i kanalmålretting og nåværende regulering.21
Til slutt presenterer studien vår den høyoppløselige strukturen til et insektmiddel-insektmiddel TRP-kanalkompleks av landbruksmessig betydning – en oppdagelse som tidligere var ukjent for oss. Det er verdt å merke seg at vi karakteriserte strukturen og funksjonen til insektkanalen i menneskeceller (HEK293S GnTi–) snarere enn i insektceller. I møte med økende insektmiddelresistens og pågående press på matsikkerhet og patogener, gir arbeidet vårt viktig informasjon som vil legge til rette for utviklingen av nye insektmidler til fordel for menneskers helse og global matsikkerhet. Studier har vist at insektmidler som AP er effektive mot noen skadedyr når de brukes i henhold til instruksjonene på etiketten, og har lav akutt toksisitet for gunstige pollinatorer, noe som demonstrerer deres miljøtrygghet.13,16Videre har testing av noen AP-derivater på mygg vist at de til slutt mister evnen til å fly. Å forstå hvordan disse modulerende forbindelsene binder seg til Nan-Iav vil legge til rette for modifisering av eksisterende forbindelser eller utvikling av nye forbindelser for mer effektive ognøyaktigskadedyrbekjempelse. Studien vår viser at Nan-Iav ARD-grensesnittet er kritisk ikke bare for å regulere aktiviteten til endogene forbindelser, plantevernmidler og Ca2+-CaM, men også for kanalmontering. Vi foreslår at det å forstyrre heterodimermonteringen med små molekyler kan være en unik og lovende tilnærming for å utvikle ionekanalhemmere.
Av de åtte ortologe genene ble fullengdegenene til brunbillen (Halyomorpha halys) Nanchung og Inactive valgt, som viste utmerket stabilitet i vaskemidler. De syntetiserte genene ble kodonoptimalisert for menneskelig uttrykk og klonet inn i pBacMam pCMV-DEST-vektoren (Life Technologies) ved bruk av XhoI- og EcoRI-restriksjonsseter. Dette sikret at klonene var i ramme med C-terminale GFP-FLAG-10xHis- og mCherry-FLAG-10xHis-taggene, som spaltes av HRC-3C-protease (PPX), noe som muliggjør uavhengiguttrykkPrimerne som ble brukt til å klone Nanchung og Inactive inn i pBacMam-vektoren var som følger:
Mikroskopiske bilder av individuelle partikler ble tatt med et Titan Krios G2 transmisjonselektronmikroskop (FEI) utstyrt med et K3-kamera og et Gatan BioQuantum-energifilter. Mikroskopet ble operert ved 300 keV, med en energiinnstilling på 20 eV, en pikselstørrelse på 1,08 Å/piksel (nominal forstørrelse på 81 000x) og en defokuseringsgradient fra -0,8 til -2,2 μm. Videoopptak ble utført med 40 bilder per sekund ved bruk av et Latitude S-mikroskop (Gatan) med en nominell dosehastighet på 25 e–px⁻¹ s⁻¹, en eksponeringstid på 2,4 s og en total dose på omtrent 60 e–Å⁻².
Stråleindusert bevegelseskorreksjon og dosevekting ble utført på film ved hjelp av MotionCor2 i RELION 4.061. Kontrastoverføringsfunksjon (CTF) parameterestimering ble utført i cryoSPARC ved hjelp av den patch-baserte CTF-estimeringsmetode62. Mikrofotografier med en CTF-tilpasningsoppløsning ≥4 Å ble ekskludert fra påfølgende analyse. Vanligvis ble et delsett på 500–1000 mikrofotografier brukt til punktvalg i cryoSPARC, etterfulgt av flere runder med 2D-klassifisering etter filtrering for å oppnå et tydelig referansebilde for malbasert partikkelvalg. Partiklene ble deretter ekstrahert ved hjelp av 64-pikslers avgrensningsbokser og 4-fold binning. Flere runder med 2D-klassifisering ble utført for å fjerne uønskede partikkelkategorier. Den første 3D-modellen ble rekonstruert ved hjelp av ab initio-rekonstruksjon og raffinert ved hjelp av ikke-uniform raffinement i cryoSPARC. 3D-klassifisering ble utført i cryoSPARC eller RELION basert på ARD-heterogenitet. Ingen signifikant heterogenitet av membrandomener ble observert. Partiklene ble raffinert ved hjelp av C1- og C2-metodene; Partikler med høyere C2-oppløsning ble ansett som symmetriske med hensyn til C2 og importert til RELION for Bayesiansk raffinering. Partiklene ble deretter overført tilbake til cryoSPARC for endelig ikke-uniform og lokal raffinering. Den endelige oppløsningen og partikkelantall er vist i tabell 1.
Ved prosessering av Nan+AP-pentamerer utforsket vi ulike metoder for å forbedre oppløsningen av membrandomener (spesielt poreområdet), som signalsubtraksjon og TMD-maskering. Disse forsøkene var imidlertid mislykkede på grunn av den potensielt ekstreme uorden i poreområdet og den generelle heterogeniteten til TMD. Den endelige oppløsningen ble beregnet ved hjelp av en maske som ble automatisk generert av den ikke-uniforme prosesseringsmetoden i cryoSPARC, primært rettet mot ARD-regionen. Dette oppnådde betydelig høyere oppløsning enn for membrandomenene (spesielt VSLD-regionen).
Innledende de novo-modeller av apo-formene til Nanchung- og Inactive-bugs ble først generert ved hjelp av Coot63, og modeller av Nan- og Iav-bugs ble generert ved hjelp av AlphaFold264 for å identifisere regioner med lav konfidens. Calmodulin-modellering var basert på rigid-body-tilpasninger av Ca2+-bindende og Ca2+-frie modeller i henholdsvis PDB-tilgangene 4JPZ56 og 1CFD65. Modellene ble raffinert ved hjelp av sfærisk raffinement for å sikre korrekt stereokjemi og god geometri. Fosfatidylkolin, fosfatidyletanolamin og fosfatidylserin ble deretter modellert som veldefinerte lipidtettheter, og NAM- og AP-ligandene ble plassert i de tilsvarende tetthetene i de tette forbindelsene. Begrensningsfiler ble generert fra SMILES-strengen til isoformene ved hjelp av eLBOW i PHENIX66. Til slutt ble modellene raffinert i reelt rom i PHENIX ved hjelp av lokalt gridsøk og global minimering med sekundære strukturbegrensninger. MolProbity-serveren ble brukt til modellforbedring og strukturell analyse, og illustrasjoner ble utført ved hjelp av PyMOL og UCSF Chimera X. 67,68,69 Blenderåpningsanalyse ble utført ved hjelp av HOLE-serveren,70 og sekvensbevaringskartlegging ble utført ved hjelp av Consurf-serveren.71
Statistisk analyse ble utført ved hjelp av Igor Pro 6.2, Excel Office 365 og GraphPad Prism 7.0. Alle kvantitative data presenteres som gjennomsnitt ± standardfeil (SEM). Students t-test (tosidig, uparet) ble brukt til å sammenligne to grupper. Enveis variansanalyse (ANOVA) etterfulgt av Dunnetts post hoc-test ble brukt til å sammenligne flere grupper. *P< 0,05, **P< 0,01, og ***P< 0,001 ble ansett som statistisk signifikante avhengig av datafordelingen. Kd- og Ki-verdier og deres asymmetriske 95 % konfidensintervaller ble beregnet ved hjelp av GraphPad Prism 10.
For mer informasjon om studiens metodikk, se sammendraget av naturporteføljerapporten som er lenket i denne artikkelen.
Den første modellen ble bygget ved hjelp av calmodulin-modellene fra PDB 4JPZ- og 1CFD-databasene. Koordinatene er lagret i Protein Data Bank (PDB) under tiltredelsesnumrene 9NVN (Nan-Iav-CaM uten ligand), 9NVO (Nan-Iav-CaM bundet til nikotinamid), 9NVP (Nan-Iav-CaM bundet til nikotinamid og EDTA), 9NVQ (Nan-Iav-CaM bundet til afenidolpyrrollin og kalsium), 9NVR (Nan-Iav-CaM bundet til afenidolpyrrollin og EDTA) og 9NVS (Nan-pentamer bundet til afenidolpyrrollin). De tilsvarende kryo-elektronmikroskopibildene er deponert i Electron Microscopy Database (EMDB) under følgende tiltredelsesnumre: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM uten ligand), EMD-49845 (Nan-Iav-CaM-kompleks med nikotinamid), EMD-49846 (Nan-Iav-CaM-kompleks med nikotinamid og EDTA), EMD-49847 (Nan-Iav-CaM-kompleks med aphidopyrrollin og kalsium), EMD-49848 (Nan-Iav-CaM-kompleks med aphidopyrrollin og EDTA) og EMD-49849 (Nan-pentamerkompleks med aphidopyrrollin). Rådataene for den funksjonelle analysen presenteres i denne artikkelen.
Publisert: 28. januar 2026