Plante- og patogenmaterialer
En sorghum-assosiasjonskartleggingspopulasjon kjent som sorghumkonverteringspopulasjonen (SCP) ble levert av Dr. Pat Brown ved University of Illinois (nå ved UC Davis). Den har blitt beskrevet tidligere og er en samling av forskjellige linjer konvertert til fotoperiode-ufølsomhet og mindre statur for å legge til rette for vekst og utvikling av plantene i amerikanske miljøer. 510 linjer fra denne populasjonen ble brukt i denne studien, men på grunn av dårlig spiring og andre kvalitetskontrollproblemer ble ikke alle linjene brukt i analysen av alle tre egenskapene. Til slutt ble data fra 345 linjer brukt til analyse av kitinresponsen, 472 linjer for flg22-responsen og 456 for TLS-resistens.B. cookeiStammen LSLP18 ble innhentet fra Dr. Burt Bluhm ved University of Arkansas.
MAMP-responsmåling
To forskjellige MAMP-er ble brukt i denne studien, flg22 (Genscript-katalognr. RP19986) og kitin. Sorghumplanter ble dyrket i innsatser lagt på flater fylt med jord (33 % Sunshine Redi-Earth Pro Growing Mix) i drivhuset. Plantene ble vannet dagen før prøveinnsamling for å unngå ekstra bladfuktighet på innsamlingsdagen.
Linjene ble randomisert og, av logistiske årsaker, plantet i grupper på 60 linjer. For hver linje ble det plantet tre «potter» med to frø per linje. Etterfølgende grupper ble plantet så snart det forrige partiet var bearbeidet, inntil hele populasjonen var vurdert. To eksperimentelle omganger ble utført for begge MAMP-ene, med genotyper randomisert på nytt i hver av de to omgangene.
ROS-analyser ble utført som tidligere beskrevet. Kort fortalt ble seks frø plantet i tre forskjellige potter for hver linje. Fra de resulterende frøplantene ble tre valgt ut basert på ensartethet. Frøplanter som så uvanlige ut eller var betydelig høyere eller kortere enn majoriteten ble ikke brukt. Fire bladskiver med 3 mm diameter ble skåret ut fra den bredeste delen av det fjerde bladet til tre forskjellige 15 dager gamle sorghumplanter. Én skive per blad fra to planter og to skiver fra én plante, hvor den andre skiven ble vannkontrollen (se nedenfor). Skivene ble individuelt fløtlagt på 50 µl H20 i en svart 96-brønns plate, forseglet med en aluminiumsforsegling for å unngå lyseksponering og oppbevart ved romtemperatur over natten. Neste morgen ble en reaksjonsløsning laget ved bruk av 2 mg/ml kjemiluminescerende probe L-012 (Wako, katalognr. 120-04891), 2 mg/ml pepperrotperoksidase (type VI-A, Sigma-Aldrich, katalognr. P6782) og 100 mg/ml kitin eller 2 μM Flg22. 50 µl av denne reaksjonsløsningen ble tilsatt tre av de fire brønnene. Den fjerde brønnen var en simulert kontroll, hvor reaksjonsløsningen uten MAMP ble tilsatt. Fire blanke brønner som kun inneholdt vann ble også inkludert i hver plate.
Etter tilsetning av reaksjonsløsningen ble luminescensen målt ved hjelp av SynergyTM 2 multideteksjonsmikroplateleser (BioTek) hvert 2. minutt i 1 time. Plateleseren foretar luminescensmålinger hvert 2. minutt i løpet av denne timen. Summen av alle 31 avlesningene ble beregnet for å gi verdien for hver brønn. Den estimerte verdien for MAMP-responsen for hver genotype ble beregnet som (gjennomsnittlig luminescensverdi for de tre eksperimentelle brønnene – mock-brønnverdien) – minus gjennomsnittlig verdi for blindbrønnen. Verdiene for blindbrønnen var gjennomgående nær null.
Bladskiver avNicotiana benthamiana, én sorghumlinje med høy respons (SC0003) og én sorghumlinje med lav respons (PI 6069) ble også inkludert som kontroller i hver 96-brønnsplate for kvalitetskontrollformål.
B. cookeiinokulumforberedelse og inokulering
B. cookeiInokulum ble fremstilt som beskrevet tidligere. Kort fortalt ble sorghumkorn bløtlagt i vann i tre dager, skylt, overført til 1-liters koniske kolber og autoklavert i en time ved 15 psi og 121 °C. Kornene ble deretter inokulert med omtrent 5 ml macerert mycel fra en fersk kultur avB. cookeiLSLP18-isolater ble trukket og latt stå i 2 uker ved romtemperatur, mens kolbene ble ristet hver 3. dag. Etter 2 uker ble de soppinfiserte sorghumkornene lufttørket og deretter lagret ved 4 °C frem til feltinokulering. Det samme inokulumet ble brukt i hele forsøket og laget ferskt hvert år. For inokulering ble 6–10 infiserte korn plassert i en virvel av 4–5 uker gamle sorghumplanter. Sporene produsert fra disse soppene initierte infeksjon i de unge sorghumplantene innen en uke.
Frøforberedelse
Før planting i åkeren ble sorghummfrø behandlet med en blanding av soppdrepende middel, insektmiddel og sikkerhetsmiddel som inneholdt ~ 1 % Spirato 480 FS soppdrepende middel, 4 % Sebring 480 FS soppdrepende middel og 3 % Sorpro 940 ES frøsikkerhetsmiddel. Deretter ble frøene lufttørket i 3 dager, noe som ga et tynt lag av denne blandingen rundt frøene. Sikkerhetsmiddelet tillot bruk av herbicidet Dual Magnum som en før-oppkomstbehandling.
Evaluering av motstand mot målbladflekker
SCP-en ble plantet ved Central Crops Research Station i Clayton, NC, 14.–15. juni 2017 og 20. juni 2018 i et randomisert komplett blokkdesign med to eksperimentelle replikasjoner i hvert tilfelle. Eksperimentene ble plantet i 1,8 m enkle rader med en radbredde på 0,9 m ved bruk av 10 frø per parsell. To kantrader ble plantet rundt periferien av hvert eksperiment for å forhindre kanteffekter. Eksperimentene ble inokulert 20. juli 2017 og 20. juli 2018, hvor sorghumplantene var i vekststadium 3. Vurderinger ble tatt på en skala fra én til ni, hvor planter som ikke viste tegn til sykdom ble vurdert som en ni og fullstendig døde planter ble vurdert som én. To vurderinger ble tatt i 2017 og fire avlesninger i 2018, startende to uker etter inokulering hvert år. sAUDPC (standardisert areal under sykdomsprogresjonskurven) ble beregnet som beskrevet tidligere.
Publisert: 01.04.2021