Plante- og patogenmaterialer
En sorghumforeningskartleggingspopulasjon kjent som sorghumkonverteringspopulasjonen (SCP) ble levert av Dr. Pat Brown ved University of Illinois (nå ved UC Davis).Det har blitt beskrevet tidligere og er en samling av forskjellige linjer konvertert til fotoperiode-ufølsomhet og mindre statur for å lette veksten og utviklingen av plantene i amerikanske miljøer.510 linjer fra denne populasjonen ble brukt i denne studien, men på grunn av dårlig spiring og andre kvalitetskontrollproblemer ble ikke alle linjene brukt i analysen av alle tre egenskapene.Til syvende og sist ble data fra 345 linjer brukt for analysen av kitinresponsen, 472 linjer for flg22-responsen og 456 for TLS-resistens.B. cookeistamme LSLP18 ble oppnådd fra Dr. Burt Bluhm ved University of Arkansas.
MAMP-responsmåling
To forskjellige MAMP-er ble brukt i denne studien flg22, (Genscript catalog # RP19986), og kitin .Sorghumplanter ble dyrket i innsatser lagt på flater fylt med jord (33 % Sunshine Redi-Earth Pro Growing Mix) i drivhuset.Planter ble vannet dagen før prøvetaking for å unngå ekstra bladfuktighet på prøvetakingsdagen.
Linjene ble randomisert og ble av logistiske grunner plantet i partier på 60 linjer.For hver linje ble det plantet tre 'potter' med to frø per linje.Påfølgende partier ble plantet så snart forrige parti var behandlet inntil hele bestanden var vurdert.To eksperimentelle kjøringer ble utført for begge MAMP-ene med genotyper re-randomisert i hver av de to kjøringene.
ROS-analyser ble utført som tidligere beskrevet.Kort fortalt, for hver linje ble seks frø plantet i 3 forskjellige potter.Fra de resulterende frøplantene ble tre valgt basert på ensartethet.Frøplanter som så uvanlige ut eller var betydelig høyere eller kortere enn de fleste ble ikke brukt.Fire bladskiver med 3 mm diameter ble skåret ut fra den bredeste delen av det 4. bladet av tre forskjellige 15 dager gamle durraplanter.En skive per blad fra to planter og to skiver fra en plante, hvor den andre skiven blir vannkontrollen (se nedenfor).Skivene ble individuelt fløt på 50 ul H20 i en svart 96-brønners plate, forseglet med en aluminiumsforsegling for å unngå eksponering for lys, og holdt ved romtemperatur over natten.Neste morgen ble det laget en reaksjonsløsning ved bruk av 2 mg/ml kjemiluminescerende probe L-012 (Wako, katalognr. 120-04891), 2 mg/ml pepperrotperoksidase (Type VI-A, Sigma-Aldrich, katalognr. P6782), og 100 mg/ml kitin eller 2 μM Flg22.50 ul av denne reaksjonsløsningen ble tilsatt til tre av de fire brønnene.Den fjerde brønnen var en falsk kontroll, til hvilken reaksjonsløsningen unntatt MAMP ble tilsatt.Fire blanke brønner som kun inneholdt vann ble også inkludert i hver plate.
Etter tilsetning av reaksjonsløsningen ble luminescensen målt ved å bruke SynergyTM 2 multi-deteksjon mikroplateleser (BioTek) hvert 2. minutt i 1 time.Plateavleseren tar luminescensmålinger hvert 2. minutt i løpet av denne 1 timen.Summen av alle 31 avlesninger ble beregnet for å gi verdien for hver brønn.Den estimerte verdien for MAMP-responsen for hver genotype ble beregnet som (gjennomsnittlig luminescensverdi for de tre eksperimentelle brønnene - den falske brønnverdien) - minus den gjennomsnittlige blanke brønnverdien.Blindbrønnverdiene var gjennomgående nær null.
Bladskiver avNicotiana benthamiana, en høyresponsiv sorghumlinje (SC0003) og en lavresponsiv sorghumlinje (PI 6069) ble også inkludert som kontroller i hver 96-brønners plate for kvalitetskontrollformål.
B. cookeiinokulumpreparering og inokulering
B. cookeiinokulum ble fremstilt som beskrevet tidligere.Kort fortalt ble sorghum korn bløtlagt i vann i tre dager, skylt, øset over i 1 L koniske kolber og autoklaveret i en time ved 15psi og 121 °C.Kornene ble deretter inokulert med ca. 5 ml maserert mycel fra en fersk kultur avB. cookeiLSLP18 isolerer og får stå i 2 uker ved romtemperatur, rist i kolbene hver 3. dag.Etter 2 uker ble de soppinfiserte sorghumkornene lufttørket og deretter lagret ved 4 °C inntil feltinokulering.Det samme inokulumet ble brukt under hele forsøket og laget ferskt hvert år.For inokulering ble 6–10 infiserte korn plassert i virvlen til 4–5 uker gamle sorghumplanter.Sporene produsert fra disse soppene initierte infeksjon i de unge sorghumplantene i løpet av en uke.
Frø forberedelse
Før planting i åkeren ble durrafrø behandlet med en blanding av soppdrepende, insektmiddel og safener som inneholdt ~ 1 % Spirato 480 FS soppdrepende middel, 4 % Sebring 480 FS soppdrepende middel, 3 % Sorpro 940 ES frøbeskytter.Deretter ble frøene lufttørket i 3 dager som ga et tynt belegg av denne blandingen rundt frøene.Safemiddelet tillot bruk av ugressmiddelet Dual Magnum som en pre-emergence-behandling.
Evaluering av målbladflekkmotstand
SCP ble plantet ved Central Crops Research Station i Clayton, NC 14.–15. juni 2017 og 20. juni 2018 i et randomisert komplett blokkdesign med to eksperimentelle replikasjoner i hvert tilfelle.Eksperimenter ble plantet i 1,8 m enkeltrader med 0,9 m radbredde ved bruk av 10 frø per tomt.To kantrader ble plantet rundt periferien av hvert eksperiment for å forhindre kanteffekter.Eksperimentene ble inokulert 20. juli 2017 og 20. juli 2018, da sorghumplantene var i vekststadium 3. Vurderinger ble tatt på en til ni skalaer, hvor planter som ikke viste tegn til sykdom ble skåret som ni og fullstendig. døde planter ble skåret som én.To vurderinger ble tatt i 2017 og fire målinger i 2018 med start to uker etter inokulering hvert år.sAUDPC (standardisert område under sykdomsprogresjonskurve) ble beregnet som beskrevet tidligere.
Innleggstid: Apr-01-2021